[發(fā)明專利]一種靈敏探針及制備方法和利用其檢測腸炎沙門氏菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710733861.4
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107478833B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建龍;張道宏;補(bǔ)彤;閆靈芝;黃瓊;竇磊娜;趙兵欣;趙東陽
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 李紅媛

1.利用一種靈敏探針檢測腸炎沙門氏菌的非診斷方法，其特征在于利用靈敏探針檢測腸炎沙門氏菌的非診斷方法具體是按以下步驟完成的：

一、制備腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條：

腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條包括襯板，襯板上貼有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜的一端覆蓋吸水墊，硝酸纖維素膜的另一端依次覆蓋樣品墊和結(jié)合墊，硝酸纖維素膜的非覆蓋面上沿橫向設(shè)置檢測線；檢測線包被有腸炎沙門氏菌單克隆抗體，結(jié)合墊及樣品墊分別經(jīng)封閉液封閉處理；

所述的腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條的制備方法如下：

①、檢測線的制備：

將腸炎沙門氏菌單克隆抗體溶于包被液中，得到腸炎沙門氏菌單克隆抗體濃度為1mg/mL的溶液；用劃線方式將腸炎沙門氏菌單克隆抗體濃度為1mg/mL的溶液以1μL/cm的速度橫向包被于距硝酸纖維素膜上沿25mm～30mm的位置上，得到檢測線，然后于36℃～37℃條件下干燥20min～30min，得到含有檢測線的硝酸纖維素膜；

②、樣品墊的制備：

將玻璃纖維膜剪裁成長為13mm～18mm，寬為2mm～4mm，再放入封閉液中浸濕，取出后在溫度為36℃～37℃下干燥10h～16h，得到樣品墊；

③、結(jié)合墊的制備：

將玻璃纖維膜剪裁成長為7mm～9mm，寬2mm～4mm，再放入封閉液中浸濕，取出后在溫度為36℃～37℃下干燥10h～16h，得到結(jié)合墊；

④、吸水墊的制備：

將吸水紙剪裁成長為16mm～20mm，寬為2mm～4mm，得到吸水墊；

⑤、組裝：

在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、含有檢測線的硝酸纖維素膜、結(jié)合墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長度為1～3mm，得到腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條；

二、取100μL待檢測液體，向100μL待檢測液體中加入5μL靈敏探針濃度為1mg/mL的重懸液，然后在溫度為35～37℃和轉(zhuǎn)速為200r/min～300r/min的搖床中充分混合孵育20min～40min，再進(jìn)行磁分離，棄去上清液，得到磁和待檢測物質(zhì)的復(fù)合物；向磁和待檢測物質(zhì)的復(fù)合物中加入100μL蒸餾水或100μL0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行重懸，得到樣品溶液；將樣品溶液逐滴滴加到腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條的樣品墊上，將其作為檢測試紙條，同時(shí)取100μL蒸餾水或100μL0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液作為陰性對照液，逐滴滴加到另一腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條的樣品墊上，將其作為對照試紙條，10min后讀取結(jié)果；

檢測結(jié)果：(1)陽性：當(dāng)腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條的檢測線顯示出黃色線條時(shí)，判為陽性，表明待檢測液體中的腸炎沙門氏菌的濃度高于或等于80CFU/mL；(2)：陰性：當(dāng)腸炎沙門氏菌的免疫層析試紙條的檢測線不顯示顏色時(shí)，判為陰性結(jié)果，表明待檢測液體中的腸炎沙門氏菌低于80CFU/mL；

步驟二中所述的靈敏探針濃度為1mg/mL的重懸液的制備方法如下：使用pH值為6.6的硼酸緩沖液對靈敏探針清洗3次～5次，再加入重懸液，得到靈敏探針濃度為1mg/mL的重懸液；

所述的靈敏探針的制備方法具體是按以下步驟完成的：

(1)、將FeCl₃·6H₂O和二水合檸檬酸三鈉加入到乙二醇中，再在溫度為36℃～37℃和轉(zhuǎn)速為200r/min～300r/min的氣浴搖床中溶解30min～60min，再加入醋酸鈉，再在溫度為36℃～37℃和轉(zhuǎn)速為200r/min～300r/min的氣浴搖床中溶解30min～60min，得到黃棕色乳狀液；

步驟(1)中所述的FeCl₃·6H₂O的質(zhì)量與乙二醇的體積比為(0.5g～1g):(10mL～30mL)；

步驟(1)中所述的FeCl₃·6H₂O與二水合檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為(0.5～1):(0.1～0.4)；

步驟(1)中所述的FeCl₃·6H₂O與醋酸鈉的質(zhì)量比為(0.5～1):(1～2)；

(2)、將步驟(1)中得到的黃棕色乳狀液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙稀內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，再將聚四氟乙稀內(nèi)襯的反應(yīng)釜在溫度為190℃～210℃的烘箱中放置8h～12h，再自然冷卻至室溫，得到黑褐色產(chǎn)物；首先使用無水乙醇對黑褐色產(chǎn)物清洗3次～5次，再使用超純水對黑褐色產(chǎn)物清洗3次～5次，最后在溫度為60℃～70℃下烘干，得到羧基化的免疫磁珠；

步驟(2)中所述的羧基化的免疫磁珠的粒徑為150nm～200nm；

(3)、將羧基化的免疫磁珠加入到蒸餾水中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，再在溫度為36℃～37℃和轉(zhuǎn)速為200r/min～300r/min的氣浴搖床中反應(yīng)20min～30min，再進(jìn)行磁分離，棄除溶劑，得到反應(yīng)物Ⅰ；使用蒸餾水清洗反應(yīng)物Ⅰ3次～5次，得到活化的磁性微球；

步驟(3)中所述的羧基化的免疫磁珠的質(zhì)量與蒸餾水的體積比為(0.8mg～1.5mg):1mL；

步驟(3)中所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的質(zhì)量與蒸餾水的體積比為(0.8mg～1.5mg):1mL；

步驟(3)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量與蒸餾水的體積比為(0.5mg～1mg):1mL；

(4)、①、將活化的磁性微球加入到pH值為6.6的硼酸緩沖液中，再加入氨芐青霉素，再在溫度為36℃～37℃和轉(zhuǎn)速為200r/min～300r/min的氣浴搖床中反應(yīng)50min～60min，再進(jìn)行磁分離，棄去上清液，得到反應(yīng)物Ⅱ；

②、向反應(yīng)物Ⅱ中加入含有1％牛血清白蛋白的pH值為6.6的硼酸緩沖液中，繼續(xù)在溫度為36℃～37℃和轉(zhuǎn)速為200r/min～300r/min的氣浴搖床中反應(yīng)50min～60min，再進(jìn)行磁分離，棄去上清液，得到靈敏探針；

步驟(4)①中所述的活化的磁性微球的質(zhì)量與pH值為6.6的硼酸緩沖液的體積比為1mg:(1mL～2mL)；

步驟(4)①中所述的活化的磁性微球與氨芐青霉素的質(zhì)量比為1:(2～5)；

步驟(4)②中所述的反應(yīng)物Ⅱ的質(zhì)量與含有1％牛血清白蛋白的pH值為6.6的硼酸緩沖液的體積比為1mg:(1mL～2mL)。