[發明專利]重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株的構建方法及所得株和應用

有效

• 申請號: 201710732719.8
• 申請日: 2017-08-24
• 公開（公告）號: CN107723269B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 趙新新;程安春;代勤龍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/116;A61K39/112;A61P31/04;C12R1/42
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 黎祖琴

本發明提供了一種重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株的構建方法，其包括步驟：以鼠傷寒沙門菌ATCC14028為基礎菌株，通過自殺質粒pRE112介導的同源重組法，構建缺失asd、crp和rfbN基因的菌株；通過Gibson組裝的方法將紐波特沙門菌ATCC 27869的O?抗原基因簇部分基因片段wzx?wbaR?wbaL?wbaQ?wzy?wbaW?wbaZ與含T1T2終止子、pSC101 origin、asd基因表達盒、Amp抗性基因盒和Ptrc啟動子的DNA骨架片段進行融合連接，構建Asd+質粒pCZ11?1；將所得Asd+質粒pCZ11?1轉入上述所得菌株，即得。本發明構建得到的重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株具有高水平的針對同源LPS和異源LPS的血清IgG應答，對同源強毒株—鼠傷寒沙門菌ATCC14028和異源強毒株—紐波特沙門菌SLN06具有100％的免疫保護效率。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株的構建方法及所得株和應用。

背景技術

非傷寒沙門菌(Not-typhoidal Salmonella)能夠引起人類、哺乳類、鳥類、爬行類等多種動物的食物源性人畜共患病，對公共衛生安全造成了重要威脅。據統計，全世界每年超過9000萬人感染NTS而引發腸胃炎，并造成至少15萬人的死亡。此外，NTS還能引起全球范圍內的免疫缺陷病人或非洲地區人群的系統性感染，引發菌血癥、敗血癥及腦膜炎等，死亡率較高。接觸受污染的動物產品，如雞蛋、肉制品等是人感染沙門菌的重要途徑，因而控制沙門菌在動物與人類間的傳播是沙門菌病防控的關鍵。

NTS血清型多達上千種，然而據研究，在人類和動物中流行的血清型主要是鼠傷寒沙門菌(Salmonella Typhimurium)、腸炎沙門菌和血清群C沙門菌(如紐波特沙門菌、豬霍亂沙門菌、嬰兒沙門菌等)。疫苗是控制疾病最經濟有效的手段，隨著沙門菌耐藥現象日益嚴重，人們意識到一種能夠預防多種血清型的沙門菌多價疫苗是防控動物和人類非傷寒沙門菌病的迫切需求。然而，目前尚無應用于人類的非傷寒沙門菌疫苗，開發的商品化動物用疫苗均為單價疫苗，交叉免疫保護力不足。

因此，本領域亟需可解決上述問題的技術出現。

發明內容

針對現有技術的缺點，本發明的目的之一在于提供一種重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株的構建方法，該方法包括如下步驟：

(1)以鼠傷寒沙門菌ATCC14028為基礎菌株，通過自殺質粒pRE112介導的同源重組法，構建同時缺失asd、crp和rfbN三個基因的菌株；

(2)通過Gibson組裝的方法將紐波特沙門菌ATCC 27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ與含T1T2終止子、pSC101 origin、asd基因表達盒、Amp抗性基因盒和Ptrc啟動子的DNA骨架片段進行融合連接，構建Asd⁺質粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(3)將步驟(2)所得Asd⁺質粒pCZ11-1轉入步驟(1)所得菌株，即得所述重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株；

所述重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株具有高水平的針對同源LPS和異源LPS的血清IgG應答，對同源強毒株—鼠傷寒沙門菌ATCC14028和異源強毒株—紐波特沙門菌具有100％的免疫保護效率；所述紐波特沙門菌對于BALB/C小鼠的LD₅₀為2x10⁷CFU。

步驟(1)中，設計6對引物分別缺失鼠傷寒沙門菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三個基因，突變順序為asd、crp、rfbN；進行利用自殺質粒pRE112介導的同源重組操作時，利用所述6對引物分別對asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂進行擴增和融合，得到融合片段，再對融合片段和質粒pRE112進行酶切和連接處理；