[發(fā)明專利]重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株的構(gòu)建方法及所得株和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710732719.8
• 申請日: 2017-08-24
• 公開（公告）號: CN107723269B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙新新;程安春;代勤龍
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/116;A61K39/112;A61P31/04;C12R1/42
• 代理公司: 成都玖和知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51238
• 代理人: 黎祖琴

1.一種重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)以鼠傷寒沙門菌ATCC14028為基礎(chǔ)菌株，通過自殺質(zhì)粒pRE112介導(dǎo)的同源重組法，構(gòu)建同時缺失asd、crp和rfbN三個基因的菌株；

(2)通過Gibson組裝的方法將紐波特沙門菌ATCC 27869的O-抗原基因簇部分基因片段wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ與含T1T2終止子、pSC101origin、asd基因表達盒、Amp抗性基因盒和Ptrc啟動子的DNA骨架片段進行融合連接，構(gòu)建Asd⁺質(zhì)粒pCZ11-1；所述wzx-wbaR-wbaL-wbaQ-wzy-wbaW-wbaZ的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(3)將步驟(2)所得Asd⁺質(zhì)粒pCZ11-1轉(zhuǎn)入步驟(1)所得菌株，即得所述重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株；

所述重組鼠傷寒沙門菌二價疫苗株具有高水平的針對同源LPS和異源LPS的血清IgG應(yīng)答，對同源強毒株—鼠傷寒沙門菌ATCC14028和異源強毒株—紐波特沙門菌具有100％的免疫保護效率；所述紐波特沙門菌對于BALB/C小鼠的LD50為2×10⁷CFU。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中，設(shè)計6對引物分別缺失鼠傷寒沙門菌ATCC14028菌株的rfbN、asd和crp三個基因，突變順序為asd、crp、rfbN；進行利用自殺質(zhì)粒pRE112介導(dǎo)的同源重組操作時，利用所述6對引物分別對asd、crp和rfbN基因的上、下游同源臂進行擴增和融合，得到融合片段，再對融合片段和質(zhì)粒pRE112進行酶切和連接處理；

所述6對引物的序列如下：

DrfbN 1F CGGGGTACCGTATGTGGTCGTACTGAC

DrfbN 1R TTTGACGAAGTTATTTTGATTCCGCCAACC

DrfbN 2F ATCAAAATAACTTCGTCAAAAGAGATAAAATA

AATG

DrfbN 2R TCCCCCCGGGGCATGTCTGACAGCTTTC

Dasd 1F CGGGGTACCCGGCGCGATTGTCGGGATG

Dasd 1RCGCCCCATAAAGCGTTTTTTTCCTGCAAAG

Dasd 2F GGAAAAAAACGCTTTATGGGGCGCCGC

Dasd 2RTCCCCCCGGGGTCCGGCTTGGGTCTGGTGC

Dcrp-1F CGGGGTACCCGCAGTTGGTGACATTCTGACG

Dcrp-1R TCTGACGGAAGCGCGGTTATCCTCTG

Dcrp-2F ATAACCGCGCTTCCGTCAGAATGGCGC

Dcrp-2R TCCCCCCGGGGCCATAGCCAGAACCAAAACCA。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，擴增所述上、下游同源臂時，反應(yīng)體系為：模板DNA1μl，2×primeSTARMax25μl，上游引物1μl，下游引物 1μl，ddH₂O 22μl；擴增條件為：94℃變性2min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃10sec，55℃15sec，72℃10sec；30個循環(huán)后，72℃延伸8min。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，進行所述融合處理時，將上下游同源臂按照摩爾數(shù)1:1的比例混合，取其中2μl作為模板，然后利用相應(yīng)引物和高保真酶primeSTARMax進行PCR擴增，得到融合片段。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，進行所述酶切和連接處理時，方法為：分別用KpnI和XmaI酶酶切融合片段和pRE112質(zhì)粒，將融合片段和質(zhì)粒酶切出互補粘性末端，并回收質(zhì)粒和片段；利用T4DNA連接酶將酶切后的融合片段與pRE112質(zhì)粒連接，16℃，過夜，轉(zhuǎn)化λpir大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞SM10中，待其長出后進行PCR鑒定，獲得陽性重組自殺質(zhì)粒。