[發(fā)明專(zhuān)利]一種敬釗毒素蛋白的高效表達(dá)及分離純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710732641.X
• 申請(qǐng)日: 2017-08-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107474127A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 霍林巨;羅玉嬌;張常昕;夏艷冬;司品法;張?jiān)世?/a>;劉一佑;金偉;雷蘭婷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南甲骨文生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/435
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/435;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/14;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及敬釗纓毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建與分離純化方法。

背景技術(shù)

瘧疾是原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)瘧原蟲(chóng)(paslmodium)引起的傳染性寄生蟲(chóng)疾病，這種疾病幾乎流行于所有的熱帶和亞熱帶國(guó)家。現(xiàn)在，每年有500百萬(wàn)人感染此病，遍及非洲、南亞次大陸、東南亞和南美洲；每年有250萬(wàn)人死于此病，其中約有1百萬(wàn)人是5歲以下的兒童。可悲的是，目前瘧原蟲(chóng)對(duì)治療瘧疾所用的藥物普遍產(chǎn)生了抗藥性(耐藥性)。抗瘧原蟲(chóng)活性的新型藥物研究成為防治瘧疾的新熱點(diǎn)。

蜘蛛利用毒液麻痹和殺死獵物，并防御其它肉食性動(dòng)物。研究發(fā)現(xiàn)，蜘蛛毒液中含有各種各樣的生物活性分子，隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與突破，部分多肽毒素分子己被開(kāi)發(fā)成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)等眾多研究領(lǐng)域的先導(dǎo)分子。

敬釗纓毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是一類(lèi)地下穴居的原始蜘蛛,隸屬狒蛛科、棒刺蛛亞科、纓毛蛛屬，是近年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的又一蜘蛛新種，產(chǎn)于廣西及海南等地。其形態(tài)與海南捕鳥(niǎo)蛛、虎紋捕鳥(niǎo)蛛十分相似，個(gè)體較海南捕鳥(niǎo)蛛大，體呈黃褐色，腹部背面無(wú)虎紋斑。毒性及兇猛程度更大，其毒液對(duì)小鼠具有致命性(IC50為0.4mg/kg)。敬釗纓毛蛛粗毒中含有多種生物活性成分。采用陽(yáng)離子交換與反相高效液相色譜技術(shù)，己從敬釗纓毛蛛粗毒中分離純化得到敬釗毒素-58(JZTX-58)。對(duì)JZTX-58的氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析,發(fā)現(xiàn)Psalmopeotoxin I和II與JZTX-58有很高的同源性，而Psalmopeotoxin I和II具有抗瘧原蟲(chóng)活性，因此推測(cè)JZTX-58具有抗瘧原蟲(chóng)活性，這對(duì)研究抑制瘧原蟲(chóng)傳播和有效治療瘧疾具有深遠(yuǎn)的意義。

敬釗纓毛蛛粗毒中含有的多肽毒素種類(lèi)很多，而其中含量較豐富的毒素分子只有極少數(shù)幾種，對(duì)于大部分含量不夠豐富的毒素分子(如JZTX-58)若用直接從粗毒中分離純化的手段則很難得到足量的毒素來(lái)進(jìn)行功能研究。因此，通過(guò)基因工程技術(shù)，構(gòu)建高效表達(dá)系統(tǒng)，來(lái)表達(dá)敬釗毒素-58(JZTX-58)蛋白，為進(jìn)一步研究JZTX-58的抗瘧原蟲(chóng)活性奠定了重要的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種敬釗毒素蛋白的高效表達(dá)及分離純化方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下技術(shù)方案：

一種敬釗毒素蛋白的高效表達(dá)方法，包含以下步驟：

(1)表達(dá)載體構(gòu)建：按照J(rèn)ZTX-58成熟肽cDNA序列設(shè)計(jì)引物，克隆到表達(dá)載體pVT102U/α，構(gòu)建表達(dá)載體pVT102U/α-JZTX-58；

(2)酵母感受態(tài)細(xì)胞制備：采用PEG/LiAc法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞；

(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞：采用熱轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pVT102U/-JZTX-58轉(zhuǎn)入制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞，形成敬釗毒素蛋白表達(dá)系統(tǒng)；

(4)敬釗毒素-58(JZTX-58)蛋白表達(dá)：選用YPD培養(yǎng)液對(duì)上述酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述步驟(1)的引物序列為：

上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，

下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。

一種敬釗毒素蛋白的分離純化方法，包含以下步驟：

(1)表達(dá)載體構(gòu)建：按照J(rèn)ZTX-58成熟肽cDNA序列設(shè)計(jì)引物，克隆到表達(dá)載體pVT102U/α，構(gòu)建表達(dá)載體pVT102U/α-JZTX-58；

(2)酵母感受態(tài)細(xì)胞制備：采用PEG/LiAc法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞；

(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞：采用熱轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pVT102U/-JZTX-58轉(zhuǎn)入制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞，形成敬釗毒素蛋白表達(dá)系統(tǒng)；

(4)敬釗毒素-58(JZTX-58)蛋白表達(dá)：選用YPD培養(yǎng)液對(duì)上述酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

(5)敬釗毒素-58(JZTX-58)蛋白分離與純化：收集酵母表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)液，采用陽(yáng)離子交換柱層析的分步洗脫方法進(jìn)行蛋白分離，采用反相高效液相色譜進(jìn)行純化。

優(yōu)選的，步驟(1)所述的引物序列為：

上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，

下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。