[發(fā)明專利]一種敬釗毒素蛋白的高效表達及分離純化方法

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• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN107474127A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 霍林巨;羅玉嬌;張常昕;夏艷冬;司品法;張允雷;劉一佑;金偉;雷蘭婷
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南甲骨文生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/14;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
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1.一種敬釗毒素蛋白的高效表達方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)表達載體構(gòu)建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列設(shè)計引物，克隆到表達載體pVT102U/α，構(gòu)建表達載體pVT102U/α-JZTX-58；

(2)酵母感受態(tài)細胞制備：采用PEG/LiAc法制備酵母感受態(tài)細胞；

(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞：采用熱轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pVT102U/-JZTX-58轉(zhuǎn)入制備好的酵母感受態(tài)細胞，形成敬釗毒素蛋白表達系統(tǒng)；

(4)敬釗毒素-58(JZTX-58)蛋白表達：選用YPD培養(yǎng)液對上述酵母表達系統(tǒng)進行擴大培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種敬釗毒素蛋白的高效表達方法，其特征在于所述步驟(1)的引物序列為：

上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA

下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。

3.一種敬釗毒素蛋白的分離純化方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)表達載體構(gòu)建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列設(shè)計引物，克隆到表達載體pVT102U/α，構(gòu)建表達載體pVT102U/α-JZTX-58；

(2)酵母感受態(tài)細胞制備：采用PEG/LiAc法制備酵母感受態(tài)細胞；

(3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞：采用熱轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pVT102U/-JZTX-58轉(zhuǎn)入制備好的酵母感受態(tài)細胞，形成敬釗毒素蛋白表達系統(tǒng)；

(4)敬釗毒素-58(JZTX-58)蛋白表達：選用YPD培養(yǎng)液對上述酵母表達系統(tǒng)進行擴大培養(yǎng)；

(5)敬釗毒素-58(JZTX-58)蛋白分離與純化：收集酵母表達系統(tǒng)培養(yǎng)液，采用陽離子交換柱層析的分步洗脫方法進行蛋白分離，采用反相高效液相色譜進行純化。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種敬釗毒素蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟(1)所述的引物序列為：

上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA

下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種敬釗毒素蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟(5)所述的陽離子交換柱層析的分步洗脫方法過程為：將表達上清液注射入系統(tǒng)中，在上樣完畢接著用0.1M NaAc、pH 4.2的平衡液沖柱子，使波長280nm處檢測值達到基線，光吸收值不再跳動，之后依次用含有0.1M、0.2M和0.3M NaCl的0.1M NaAc、pH 4.2的緩沖液進行洗脫，收集各洗脫峰。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種敬釗毒素蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟(5)所述的采用反相高效液相色譜進行純化過程為：檢測波長為280nm，反相柱溫度為40℃，先用體積分數(shù)0.1％TFA的雙蒸水脫鹽10min，將所收集各洗脫峰的溶液上Waters的C18反相柱進行脫鹽，按照制定的洗脫梯度進行洗脫，收集洗脫峰時標記好各峰的出峰時間。