[發明專利]肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062及其鑒定方法

有效

• 申請號: 201710731820.1
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN107630023B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 姜巨全;孟琳;徐桐;孟凡奎;張瑞;王利丹;陳慧文
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/195;C05F11/08;C05G3/80;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 成都東恒知盛知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 51304
• 代理人: 何健雄

本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062及其鑒定方法，肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062序列全長552bp，含一個完整開放閱讀框ORF，ORF的核苷酸序列為SEQ ID NO.1；鑒定方法包括：通過基因文庫和功能互補相結合的方法，以0.2M NaCl的氨芐抗性固體培養基作為篩選工具，得到含有耐鹽堿基因的片段等等。本發明所提出的Hz_duf2062基因對鹽堿地土壤改良具有重要意義，可用于構建高效的耐鹽堿工程菌、開發微生物肥料和提高植物耐鹽堿性的轉基因領域的應用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其一種肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062 及其鑒定方法。

背景技術

高鹽堿環境不僅對細菌細胞本身產生毒害作用，而且高濃度的滲透壓和離子壓力也嚴重影響了細菌的正常生理功能。同時，在農業生產上具有重要經濟價值的，并可作為微生物肥料的細菌耐鹽堿能力卻十分有限，諸如根瘤菌、固氮菌、磷細菌、鉀細菌和根際促生菌等，這嚴重制約著其在農業生產中的應用前景。解決其最為有效的辦法之一就是從耐鹽堿細菌中克隆高效的耐鹽堿基因，再將其導入可用作微生物肥料的細菌，構建高效耐鹽堿基因的工程菌株。所以，細菌耐鹽堿基因的克隆與功能鑒定及其耐鹽堿分子遺傳機制的研究在過去的幾十年中一直是一個重要的研究課題。

與一般非嗜鹽菌相比，嗜鹽菌中耐鹽堿基因種類更多，其耐鹽堿分子遺傳機制也更加復雜。因此，從這類菌中獲得新型的耐鹽堿基因以及高效耐鹽堿的關鍵基因的幾率更大，不僅可以增進人們對細菌耐鹽分子遺傳機制的了解，而且所克隆的關鍵耐鹽堿基因還可以用于構建高效耐鹽堿的基因工程菌株。此外，細菌與植物的耐鹽堿分子遺傳機制具有很大的相似性，它們在高鹽堿條件下，均在細胞內積累相似的親合性物質，并且采用相似的陽離子轉運蛋白等轉運鈉離子等陽離子。因此，嗜鹽菌中耐鹽堿基因的克隆和功能研究對理解植物的耐鹽堿分子遺傳機制具有重要的啟示作用，并且關鍵耐鹽堿基因還可以用于構建耐鹽堿的轉基因植物或有效的耐鹽堿微生物肥料。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

現有的土壤改良的微生物肥料和植物不具有抵御高鹽堿的能力；沒有結合規模化地發掘高效耐鹽堿的新功能基因構建相應基因工程菌株微生物肥料和轉基因植物進行改良，缺乏高效耐鹽堿細菌資源庫的構建及關鍵新功能基因的發掘理論指導。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因 duf2062及其鑒定方法。

本發明的目的是從肇東鹽單胞菌中獲得新型或者高效耐鹽堿的關鍵基因，用以深入研究細菌耐鹽堿的分子機制，以及構建轉基因耐鹽堿作物和微生物，進而充分開發和利用鹽堿地。。因此，通過基因文庫和功能互補相結合的方法，我們在基因文庫構建中常以載體所攜帶的抗性作為篩選條件之外，利用鹽敏感缺陷株E.coli KNabc的生理特性，還在篩選培養基中加入0.2M NaCl作為第二條件，成功地從肇東鹽單胞菌中克隆到耐鹽堿基因duf2062，所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062序列全長552bp，是一個完整開放閱讀框ORF，ORF的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

本發明的另一目的在于提供一種利用上述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062 編碼的Hz_DUF2062蛋白；核苷酸序列為SEQ ID NO.2。

進一步，所述Hz_DUF2062蛋白在熒光猝滅實驗中該蛋白展現出明顯的Na⁺ (Li⁺、K⁺)/H⁺逆向轉運蛋白活性，且Na⁺(Li⁺、K⁺)/H⁺逆向轉運蛋白活性具有pH依賴性。

本發明的另一目的在于提供一種肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062的鑒定方法包括：