[發明專利]肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062及其鑒定方法

有效

• 申請號: 201710731820.1
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN107630023B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 姜巨全;孟琳;徐桐;孟凡奎;張瑞;王利丹;陳慧文
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/195;C05F11/08;C05G3/80;G01N21/64;C12R1/19
• 代理公司: 成都東恒知盛知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 51304
• 代理人: 何健雄

1.一種肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062，其特征在于：所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062序列全長552 bp，含一個完整開放閱讀框ORF，ORF的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

2.一種利用權利要求1所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062編碼的Hz_DUF2062蛋白，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

3.如權利要求2所述的Hz_DUF2062蛋白，其特征在于：所述Hz_DUF2062蛋白在熒光猝滅實驗中具有Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白活性 、Li⁺/H⁺逆向轉運蛋白活性或K⁺/H⁺逆向轉運蛋白活性，以上所述逆向轉運蛋白活性具有pH依賴性。

4.一種如權利要求1所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062的鑒定方法，其特征在于，所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062的鑒定方法包括：

（1）通過現有技術基因文庫與功能互補相結合的方法，以0.2 M NaCl的氨芐抗性固體培養基作為篩選工具，得到含有耐鹽堿基因的片段；

（2）利用現有的生物信息學軟件對基因片段進行分析，確定耐鹽堿相關基因，通過PCR擴增得到Hz_duf2062基因，構建含有Hz_duf2062基因的原核表達載體pET-19b-duf2062，用以表達Hz_DUF2062蛋白；

（3）通過基因功能互補的方法，對該基因的生理功能進行鑒定；

再通過熒光猝滅技術手段，以吖啶橙作為熒光探針，檢測熒光猝滅及恢復情況，對Hz_duf2062基因編碼的Hz_DUF2062蛋白功能進行鑒定。

5.如權利要求4所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062的鑒定方法，其特征在于：構建含有Hz_duf2062基因的原核表達載體pET-19b-duf2062的方法包括：根據Hz_duf2062基因序列，首先利用Primer5軟件設計duf2062-F/ duf2062-R特異引物，并在基因的5’和3’端分別引入Nde I、BamH I兩個酶切位點，然后進行Hz_duf2062基因的PCR擴增，預期擴增中間序列片段長度為561 bp；

將PCR擴增產物末端加“A”后連入pEASY-T3載體，然后轉化到Trans1-T1感受態細胞中，進行藍白斑篩選獲得亞克隆；

再用Nde I、BamH I兩種內切酶處理連有Hz_duf2062基因的pEASY-T3-duf2062，并同時對表達載體pET19b做相同處理，對處理后的pET19b和Hz_duf2062基因片段進行回收并連接，通過轉化的方法將構建好的表達載體pET-19b-duf2062導入異源表達宿主E. coliKNabc中。

6.一種利用權利要求1所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062構建的耐鹽堿工程菌。

7.一種利用權利要求1所述肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062制備的微生物肥料。

8.一種利用權利要求2所述的肇東鹽單胞菌耐鹽堿基因duf2062編碼表達的具有Na⁺/H⁺逆向轉運活性的蛋白。