[發明專利]一種基于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶聯免疫吸附測定方法

有效

• 申請號: 201710731484.0
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN107328939B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 何治柯;劉宇澄;吉邢虎
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了一種基于生物素化抗原或抗體?無機鹽雜化納米花的酶聯免疫吸附測定方法。屬于免疫學檢測領域。該方法利用鏈霉親和素和生物素的快速高效特異性作用，將生物素化抗原或抗體?無機鹽雜化納米花快速偶聯到鏈霉親和素修飾的酶標板上，解決了傳統ELISA抗體包被需過夜反應的問題；其次，由于生物素化抗原或抗體?無機鹽雜化納米花具有較高的穩定性，使其在常溫條件下放置下仍有較好的活性；最后，所合成的生物素化抗原或抗體?無機鹽雜化納米花具有三維層狀結構，對后續抗體或抗原的捕獲更為高效，有利于提高檢測靈敏度。本發明提供的方法只需要提供生物素化的不同抗原或抗體，就能實現不同抗體或抗原的檢測，具有高適用性。

技術領域

本發明涉及一種免疫學檢測方法，尤其涉及一種基于生物素化抗原或抗體- 無機鹽雜化納米花的酶聯免疫吸附測定方法。

背景技術

酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),指將可溶性的抗原或抗體吸附到固相載體上，利用抗原-抗體結合專一性，進行免疫反應的定性和定量檢測方法。自從Engvall和Perlmann于1971年發明以來該方法得到了迅猛的發展，已廣泛應用于各種抗原抗體的檢測。

夾心ELISA方法是目前最為常用的抗原和抗體的檢測手段，該方法具有操作簡單、快速、靈敏等優點。其基本原理是，檢測抗體時，把相應的抗原分子包被在聚苯乙烯固相載體上，加入被檢測樣品，孵育，洗滌，加入酶標抗抗體，再孵育、洗滌，然后加入酶底物顯色，在酶標儀上讀取數據，根據底物顯色反應的強弱來判斷被檢樣品中抗體的含量；檢測抗原時，把針對該抗原的抗體分子包被在固相載體上，加入被檢樣品，孵育，洗滌，再加入被檢抗原的另一種抗體(二抗)，孵育，洗滌，加入酶標抗二抗的抗體，再孵育、洗滌，最后加入酶底物顯色，讀數，根據顏色反應的強弱來判斷樣品中抗原的含量。

但是傳統的酶聯免疫吸附實驗存在一些不足,例如抗體或抗原包被過程耗時長、費用高、批次間差異大，以及抗體或抗原需要嚴格的低溫保存條件；此外盡管夾心ELISA方法敏感性高，但隨著生命科學、醫學和光學檢測領域的發展，簡單快捷的ELISA方法的敏感性依然亟待。因此，如何解決抗體或抗原包被時間過長、抗體或抗原穩定性差、抗體或抗原捕獲效率較低等問題，實現快速高效檢測成為當前酶聯免疫吸附法研究的重點。

發明內容

針對傳統酶聯免疫吸附法(以下稱為“2D ELISA”)存在的問題，本發明采用仿生合成的策略制備了生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花，構建了三維層狀結構的免疫分析方法(以下稱為“3D ELISA”)。該方法利用鏈霉親和素和生物素的快速高效特異性作用，將生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花快速偶聯到鏈霉親和素修飾的酶標板上，解決了傳統ELISA抗體包被需過夜反應的問題；其次，由于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花具有較高的穩定性，使其在常溫條件下放置下仍有較好的活性；最后，所合成的生物素化抗原或抗體 -無機鹽雜化納米花具有三維層狀結構，對后續抗體或抗原的捕獲更為高效，有利于提高檢測靈敏度(圖1)。

實現本發明上述目的所采用的技術方案為：

第一方面，提供一種基于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于，將生物素化的抗原或抗體，與硫酸銅溶液一起加入到pH值為6.8～7.4的磷酸緩沖溶液中，得到生物素化的抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復合物，與鏈霉親和素修飾的酶標板在37℃孵育，將孵育有生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶標板用于待測樣品的酶聯免疫吸附測定。

具體地，本發明的酶聯免疫吸附測定方法包括以下步驟：

(a)將磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，氯化鈉解于去離子水中，調節混合溶液的pH值至6.8～7.4，得到磷酸緩沖溶液，再加入硫酸銅溶液和生物素修飾的抗原或抗體，搖勻后室溫放置18h，得到生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復合物；