[發明專利]一種基于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶聯免疫吸附測定方法

有效

• 申請號: 201710731484.0
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN107328939B
• 公開（公告）日: 2018-10-26
• 發明（設計）人: 何治柯;劉宇澄;吉邢虎
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種基于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶聯免疫吸附測定方法，其特征在于，將生物素化的抗原或抗體，與硫酸銅溶液一起加入到pH值為6.8~7.4的磷酸緩沖溶液中，得到生物素化的抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復合物，與鏈霉親和素修飾的酶標板在37℃孵育，將孵育有生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶標板用于待測樣品的酶聯免疫吸附測定。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

（a）將磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，氯化鈉溶解于去離子水中，調節混合溶液的pH值至6.8~ 7.4，得到磷酸緩沖溶液，再加入硫酸銅溶液和生物素修飾的抗原或抗體，搖勻后室溫放置18 h，得到生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復合物；

（b）將所得生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復合物離心得沉淀，用水洗滌2 ~4次，得洗滌后的生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復合物；

（c）將洗滌后的生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復合物均勻分散在PBST緩沖溶液中, 置于鏈霉親和素修飾的孔板中，37℃孵育30 ~ 120 min后，用洗液洗滌五次，再加入2% BSA溶液，于37℃封閉45min, 得包被有生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶標板，置于4℃保存備用；所述的洗液為PBST 緩沖溶液，其中磷酸鹽緩沖溶液濃度為10mM ,NaCl的濃度為150mM, Tween 20的濃度為0.05%, pH為7.2；

（d）將待測樣品加入包被有生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶標板中，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應45 min；

（e）棄去上清液，PBST緩沖液洗滌五次，拍干，每孔加入50 μL HRP標記的抗目標物抗體，37℃反應45 min；

（f）溫育后，棄去孔內液體，洗板5次，拍干，每孔加入TMB顯色工作夜50μL，37℃避光顯色10 min，依序每孔加硫酸終止液50 μL，終止反應，此時溶液顏色由藍色立即轉為黃色；

（g）用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值），或將溶液轉入比色皿，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450 nm波長處的吸收值，通過顏色深淺或吸收強度可對待測物進行可視化半定量檢測或定量測定。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（a）所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.1M，所述的硫酸銅溶液的濃度為10 ~ 200 mM，所述的生物素修飾的抗原或抗體為生物素修飾的甲胎蛋白AFP單克隆抗體，濃度范圍為0.001~ 0.5 mg/mL；步驟（b）每次離心時的轉速為10000 r/min，離心時間為10 min；步驟（e）所述的抗目標物抗體為抗AFP抗體，濃度為20μg/μL；步驟(f) 中硫酸終止液濃度為2M H₂SO₄。