[發明專利]基于聚苯胺沉積的電化學傳感電極定量檢測多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1活性的方法

在審

• 申請號: 201710729580.1
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN108241013A
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發明（設計）人: 劉勇;范佳慧;衛偉
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李明

一種基于聚苯胺沉積的電化學傳感電極定量檢測多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶?1(PARP?1)活性的方法，包括以下步驟：帶有巰基的特定DNA雙螺旋結構在金電極上的修飾激發PARP?1的特定單元；一部分PARP?1作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的催化劑，將NAD⁺裂解為多聚腺苷二磷酸核糖(PAR)和尼克酰胺兩部分，一部分作為連接劑連接PAR單元；PARP?1反復催化后PAR負電單元的形成；聚苯胺沉積的電化學傳感電極；利用電化學方法對產生的聚苯胺的電流信號進行檢測從而檢測PARP?1的活性。本發明與傳統的酶聯免疫吸附測定、測定剩余NAD⁺底物的方法相比，能夠定量測量PARP?1的活性，且極大地提高了靈敏度。本發明無需制備復雜材料，具有成本低、快速、簡便的優點。

技術領域

本發明涉及一種定量檢測多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1技術，屬于生物傳感技術領域。

背景技術

多聚腺苷二磷酸聚合酶-1(PARP-1)是存在于多數真核細胞中的一個多功能蛋白質翻譯后修飾酶。PARP-1參與DNA修復和轉錄調控，且在DNA損傷后修復和維持基因完整性中起重要作用。PARP-1受到一些DNA的激發，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的存在下，一部分PARP作為NAD⁺的催化劑，將NAD⁺裂解為多聚腺苷二磷酸核糖(PAR)和尼克酰胺兩部分，一部分作為連接劑連接PAR單元，該PAR單元是線性或帶分支的，約有200個，且帶有負電。研究表明，聚-ADP-核糖基化是蛋白質翻譯后的重要修飾方式之一，與細胞的發育、分化、凋亡及多種腫瘤的發生發展等很多重要的生命活動相關。同時，PARP-1抑制劑選擇性致死同源重組修復缺陷的細胞，這種合成致死現象也是抗腫瘤治療的新方向。

目前PARP-1檢測方法主要有酶聯免疫吸附法(ELISA)、放射性標記NAD⁺、生物素標記NAD⁺、化學定量等方法。酶聯免疫吸附法靈敏度高、重復性好，然而此法存在交叉反應，可能導致檢測值比真實值偏高，定量的方法耗時長，成本相對較高。通過檢測放射性強度來檢測PAR對儀器要求相對較高，且對操作人員安全性低。生物素標記的NAD⁺因結構的改變導致動力學性質的變化而影響測定結果。因此，對PARP-1分析的簡單、靈敏、低成本的原位實時監測仍然是當前亟待解決的問題。電化學生物傳感器基于靈敏度高，易微型化，能在復雜體系樣品中進行檢測的特點，在近幾年已成功地應用于多種癌癥標志物的檢測。

本發明基于靈敏度高，易微型化，能在復雜體系樣品中進行檢測的電化學生物傳感器，對PARP-1實現了高靈敏度檢測。通過巰基自組裝的方法將特定的雙鏈DNA修飾于金電極表面，與PARP溫育后，加入催化底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)，PARP-1反復催化后形成線性或帶分支的多聚腺苷二磷酸核糖鏈(PAR)。鏈上會發生過氧化物酶催化苯胺到聚苯胺的特異性氧化反應，聚苯胺的還原得到很強的電化學響應信號。比起其他檢測PARP-1的方法，該方法避免了成本過高、干擾因素多、實驗步驟復雜等缺點，且極大地提高了檢測靈敏度。

發明內容

技術問題：本發明提供一種基于聚苯胺沉積的電化學檢測多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1 (PARP-1)的方法。

技術方案：本發明利用聚苯胺(PANI)其卓越的氧化還原特性及良好的環境穩定性，構造出生物傳感電極。過氧化物酶能夠有效催化氧化苯胺產生聚苯胺，通過PAR與聚苯胺的靜電吸附作用，聚苯胺能夠很好地聚集在PAR周圍，因而能在電極上還原得出電化學信號，而電化學信號的大小與PARP-1濃度有很好的線性關系，因為可以定量檢測PARP-1的活性。

有益效果：本發明與傳統方法相比，能夠定量測量多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1) 的活性，且極大的提高了靈敏度。本發明無需制備復雜材料，具有成本低、快速、簡便的優點。且該方法可用于實際樣品的檢測，具有一定的臨床意義。

附圖說明