[發明專利]基于聚苯胺沉積的電化學傳感電極定量檢測多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1活性的方法

在審

• 申請號: 201710729580.1
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN108241013A
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發明（設計）人: 劉勇;范佳慧;衛偉
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李明

1.一種基于聚苯胺沉積的電化學傳感電極定量檢測多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)活性的方法，包括以下步驟：

1)帶有巰基的特定雙鏈DNA在金電極上的修飾得到激發PARP-1的修飾電極；

2)PARP-1受到特定雙鏈DNA的激發，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)的存在下，一部分PARP-1作為NAD⁺的催化劑，將NAD+裂解為多聚腺苷二磷酸核糖(PAR)和尼克酰胺兩部分，一部分作為連接劑連接PAR單元；

3)PARP-1反復催化后形成線性或帶分支的帶有負電的PAR；鏈上會通過靜電吸附過氧化物酶催化苯胺形成的聚苯胺，聚苯胺發生特異性氧化反應，得到強電化學響應信號；

4)利用電化學方法對產生的聚苯胺的電流信號進行定量分析從而檢測PARP-1。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1)的具體步驟如下：將5′端修飾了巰基的特定雙鏈DNA-1稀釋在40～50μL固定溶液和0.5～2μL三(2-羧乙基)膦(TCEP)中，配成終濃度為0.5～2μM的樣品，然后將配好的樣品滴加到清洗干凈的電極表面，蓋上燒杯，常溫過夜組裝即得，再將電極溫育于0.5～2mM巰基己醇溶液0.5～1小時，用PBS緩沖溶液沖洗后，將終濃度0.5～2μM特定雙鏈DNA-2滴加到上述電極，溫育1～3小時。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟2)的具體步驟如下：PBS緩沖液沖洗步驟1)得到的電極的表面在電極表面滴加濃度不同的PARP-1，室溫反應1小時，PBS緩沖液沖洗，滴加NAD⁺溶液，室溫反應1小時，即得PAR負電單元的電極。

4.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中的NAD⁺溶液的濃度為300～800μM。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟3)為將修飾好的電極溫育在含有苯胺、過氧化氫和過氧化氫酶的電解液中；苯胺和過氧化氫的濃度均為80～120mM。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟4)中過氧化氫酶的濃度為80～120mM。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定溶液為含有10mM Tris和100mMNaCl的pH＝7.4溶液，所述步驟3)中電解液為含有100mM CH₃COOH和CH₃COONa的pH＝4.3的緩沖溶液。

8.根據權利要求1或5所述的方法，其特征在于：所述步驟3)的反應時間為60～120min。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟4)的具體步驟如下：將步驟3)修飾好的電極作為工作電極，用一個鉑電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極，形成三電極體系，掃描方法為差分脈沖伏安法，緩沖溶液中執行參數的設置如下：電壓范圍-0.5V到0V；電位增量：0.004V；脈沖寬度：0.05s；采樣寬度：0.0167s；脈沖周期：0.2s；靜置時間：2s。

10.一種基于聚苯胺沉積的電化學傳感電極定量檢測多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)活性抑制劑的方法，包括以下步驟：

1)帶有巰基的特定DNA雙鏈DNA在金電極上的修飾得到激發PARP-1的修飾電極；

2)將不同濃度的苯甲酰胺與AG14699抑制劑與0.5U的PARP-1反應2h后，將該溶液滴加到步驟1)的電極上，室溫反應1小時；

3)滴加NAD⁺溶液，室溫反應1小時；

4)將修飾好的電極溫育在含有苯胺、過氧化氫和過氧化氫酶的電解液中；

5)利用電化學方法對產生的聚苯胺的電流信號進行定量分析從而得出抑制劑的IC₅₀值。