[發明專利]一種豬附紅細胞體病快速鏡檢診斷試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201710726649.5
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107589117A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 周思旋;徐健;徐洪忠;肖芳萍;黃波;潘紅
• 申請（專利權）人: 貴州省畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N21/84
• 分類號: G01N21/84;G01N1/28;G01N1/31
• 代理公司: 貴陽派騰陽光知識產權代理事務所(普通合伙)52110
• 代理人: 田江飛

技術領域：

本發明屬于獸醫學檢驗領域，具體涉及一種豬附紅細胞體病快速鏡檢診斷試劑盒及其制備方法。

背景技術：

附紅細胞體病是附紅細胞體寄生在人或多種動物的紅細胞表面、血漿和骨髓而引起的一種人畜共患病。過去國際上將附紅細胞體列為立克次氏體，但是近年來根據16SrRNA基因序列分析，附紅細胞體在分類上更接近于支原體屬(Mycoplasma)。豬附紅細胞體(Eperythrozoonsuis，E.suis)是一種寄生于豬紅細胞表面或游離于血漿的病原體，可引起新生仔豬和斷奶仔豬虛弱和貧血，肥育豬生長緩慢，母豬繁殖障礙、受胎率低、不發情、流產和死胎等綜合性癥狀，嚴重威脅著畜牧業的發展和人類健康。目前已經造成了巨大的經濟損失，并呈范圍擴大趨勢，因而引起國內外學者的廣泛關注。

臨床上該病的診斷方法主要以直接鏡檢為主，其中包括鮮血壓片和涂片，但是假陽性率高。動物實驗方法是確診的有效手段，但費時間太長，費用高。血清學方法包括間接血凝試驗(IHA)、補體結合試驗(CFT)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等，由于附紅細胞體病的抗體變化起伏較大，這些方法也不適用于該病診斷。PCR診斷方法有很強的特異性，但技術要求較高，檢測操作影響因素較多。

發明內容：

本發明為了解決上述問題，提供了一種豬附紅細胞體病快速鏡檢診斷試劑盒及其制備方法，該試劑盒配套科學合理，檢測方法簡單，檢測準確率高達98％，與豬附紅細胞體病PCR診斷試劑盒準確率相當。

具體地，本發明提供了一種豬附紅細胞體病快速鏡檢診斷試劑盒，由檢測試劑、器皿器械組成，所述的試劑由瑞氏染料、姬姆薩染料、甘油、吐溫-20、甲醇組成，所述的器皿器械由試劑瓶、膠頭滴管組成。

上述所述的試劑純度均要求為優級純。

本發明還提供了一種豬附紅細胞體病快速鏡檢診斷試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1、快速鏡試劑盒器皿器械的洗滌：

1.1將所需玻璃器皿放入裝有強酸氧化清洗劑的玻璃器皿缸中浸泡過夜；

1.2取出經強酸氧化清洗劑浸泡過夜的玻璃器，用熱肥皂液進行清洗，反復用自來水沖洗5次，用蒸餾水浸泡1小時取出玻璃器皿自然濾干。

1.3將玻璃器皿放入干燥消毒箱138℃干熱消毒1小時，冷卻后取出放入35℃恒溫干燥箱備用。

1.4滴管頭、塑料試劑瓶瓶的洗滌：將滴管頭和塑料瓶放入清水中浸泡30分鐘；將清水中浸泡過的滴管頭和塑料瓶用熱肥皂液進行清洗，反復用自來水沖洗5次，用蒸餾水浸泡1小時，取出滴管頭和塑料瓶自然濾干。

1.5將滴管頭和塑料瓶放入高壓消毒鍋15磅消毒30分鐘，冷卻后取出放入35℃恒溫干燥箱干燥備用。

2、快速鏡試劑盒試劑的配制：

2.1瑞氏染料和姬姆薩染料稱量前事先放入30-40℃溫箱干燥箱過夜；

2.2分別稱?。喝鹗先玖戏?-1.8g、姬姆薩染料1-1.8g。

2.3分別量取：甘油20-36ml、吐溫-20 4-8ml、甲醇1000ml。

2.4將稱取的瑞氏染料和姬姆薩染料放置乳缽內，用乳棒輕輕敲碎染料成粉末，再行研磨至細粉末；

2.5在乳缽內加入甘油溶解染料，使染料在乳缽內顯現鏡面光澤，而無染料粉粒附著，加適量甲醇進行研磨，靜置片刻，將上層液體倒入一清潔的2000ml容量瓶中；

2.6再加入甲醇研磨，重復數次，直至乳缽內無染料為止；

2.7在容量瓶中加入吐溫-20，用甲醇定容于2000ml；搖勻并密封瓶口，存室溫暗處24小時后過濾一次，2周后再過濾一次，即可使用；染色液儲存愈久，則染料溶解、分解越充分，此過程為染色液的熟化過程，儲存3個月以上染色效果更佳，注意密封避光保存，長期有效。

3、試劑盒包裝加工工藝：

包裝盒規格為120mm×70mm×70mm，盒內可存放兩個20mL試劑瓶及兩只膠頭滴管，對試劑盒的瓶簽、說明書、封口簽進行檢驗。

4、試劑盒的分裝：

4.1取甲醇15ml裝入經消毒干燥后的白色試劑瓶，瓶簽標記為I液；

4.2取熟化后的染液15ml裝入經消毒干燥后的棕色試劑瓶，瓶簽標記為II液；

4.3在盒內放入I液、II液，并放入兩只膠頭滴管和試劑盒使用說明書，包裝封口，即為豬附紅細胞體病快速鏡檢診斷試劑盒；

上述所述步驟2.1是將瑞氏染料和姬姆薩染料稱量前事先放入38℃溫箱干燥箱過夜；

上述所述步驟2.2分別稱?。喝鹗先玖戏?.4g、姬姆薩染料1.4g。