[發明專利]一種自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法

在審

• 申請號: 201710725656.3
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107362391A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 胡火珍;宋麗萍;楊燕;肖春;謝小琴;王曦;李利;張澤辛;張娟;羅旭梅;彭芳芳;薛紅;劉佩娜;葉林;胡章蘭;黃娟;鄒琳
• 申請（專利權）人: 四川馳鼎盛通生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36;A61L27/24;A61L27/50;A61L27/60;A61K8/99;A61K8/98;A61K8/65;A61Q19/00;A61Q19/08
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 夏艷

技術領域

本發明屬于抗衰老美容產品技術領域，尤其涉及一種自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法。

背景技術

日前，市場上已經有各種美容方面的產品，肉毒桿菌內毒素作為目前主流的美容產品，因其使用簡便、效果顯著、安全可靠而廣受歡迎。但它們使用后的副反應較多，常見的有表情不自然、畏光流淚、局部腫脹、淤斑、注射部位麻木、頭痛、額部緊繃感、鄰近部位皺紋加深等。這兩種因子應用易產生較明顯的依賴性，隨著注射的次數增多，人對其敏感性降低，導致病人使用該方法更為頻繁，每次的使用量也會逐漸增多。在皮膚老化的過程中，成纖維細胞(Fibroblasts，Fbs)會出現一系列生物學特性改變，真皮組織中成纖維細胞及其所分泌的膠原蛋白的減少，不僅膠原纖維的總量下降，不同類型膠原纖維的比例也發生變化，是皮膚老化并呈現各種皺紋的主要原因。這些變化最終都使真皮變薄、退化而衰老。本發明針對皮膚衰老、疤痕形成的主要原因，制備全部由自體的成分——自體皮膚成纖維細胞、自體PRP及自體膠原蛋白構成的制劑，作為自身移植材料，具有良好的組織相容性，在皮膚的年輕化和治療性塑型中發揮重要作用。自體Fbs移植術后形態自然、療效持久、無排斥反應，在維持皮膚年輕化，抗衰老方面具有較好的效果。具有安全、有效、維持時間長的特點。當然，目前市場上應用的成纖維細胞是單純的自體成纖維細胞注射填充液，有的添加一些外源生長因子，這有可能發生過敏反應。自體PRP中含有大量多種自體生長因子，這些生長因子可促進包括移植的Fbs在內的存活、增殖，填充修復損傷皮膚或祛除皺紋。

發明內容

本發明的目的在于提供一種自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法，旨在解決成纖維細胞安全、有效、維持時間長的個體化定制制劑的問題。

本發明是這樣實現的，一種自體三聯皮膚成纖維細胞制劑，所述自體三聯皮膚成纖維細胞制劑由字體PRP、自體膠原濃縮液和成纖維細胞組成；

PRP與膠原濃縮液體積比為1:4混勻作為基礎液，加入自體成纖維細胞，終濃度是1.0×10⁷/ml～2.0×10⁷/ml。

本發明的另一目的在于提供一種所述自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法，所述自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法包括以下步驟：

步驟一，人皮膚成纖維細胞分離、培養；

步驟二，自體高濃度膠原蛋白液的制備；

步驟三，自體血小板富集血漿的制備；

步驟四，三聯成纖維細胞注射制劑制備。

進一步，所述步驟一具體包括：

(1)標本處理：皮膚標本放于無鈣鎂磷酸緩沖液(DPBS)瓶中，4℃保存，帶回GMP級實驗室；將取回的標本置于生物安全柜，標本移入平皿內，首先用1×DPBS 5ml浸潤15min，用1ml移液槍吸棄，再用1×DPBS同樣反復沖洗，然后用500u/ml氨芐青霉素和500mg/ml硫酸鏈霉素的1×DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用1×DPBS液用力反復沖洗5次，直至標本發白，輕度發脹，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，將標本剪粹，后面相同；

(2)分離：用1mg/ml的混合膠原酶MNP-S在37℃條件下消化1h，分離表皮與真皮；去除表皮，真皮組織剪成約0.1mm³～0.3mm³大小，加入Tryple select無動物源性消化液，37℃條件下繼續消化15min；當成纖維細胞大部分從組織中分離出來時，加入10％FBS高糖-DMEM培養基終止消化，移入離心管，1000r/min離心5min，收集沉淀；

(3)培養和傳代，將獲得的細胞及剩余的組織塊一并接種于75cm²培養瓶中，加入1ml完全培養基，注意切勿使培養物浮起，置37℃5％CO₂培養箱中培養；于培養24h后補充培養液，此后隔3d半定量換液；原代細胞融合至70％時，Tryple select無動物源性消化液消化，200目過濾去除組織塊，按照1：2比例轉入T175傳代；從P2代開始加含10％自體血清培養基，以1:5的比例傳代，培養至第四代，獲得2×10⁸～3×10⁸成纖維細胞。

進一步，所述步驟二具體包括：自體真皮成纖維細胞在體外培養擴增過程中，分泌膠原蛋白、纖連蛋白。在換液時，將所有含分泌蛋白上清全部收集，放于離心管，采用冷凍濃縮技術濃縮，獲得高濃度膠原蛋白>1500ug/ml，放于4℃冰箱無菌保存。

進一步，所述步驟三具體包括：