[發明專利]一種自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法

在審

• 申請號: 201710725656.3
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107362391A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 胡火珍;宋麗萍;楊燕;肖春;謝小琴;王曦;李利;張澤辛;張娟;羅旭梅;彭芳芳;薛紅;劉佩娜;葉林;胡章蘭;黃娟;鄒琳
• 申請（專利權）人: 四川馳鼎盛通生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/36;A61L27/24;A61L27/50;A61L27/60;A61K8/99;A61K8/98;A61K8/65;A61Q19/00;A61Q19/08
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 夏艷

1.一種自體三聯皮膚成纖維細胞制劑，其特征在于，所述自體三聯皮膚成纖維細胞制劑由富血小板血漿、自體膠原濃縮液和自成纖維細胞組成；

血小板血漿、自體膠原濃縮液體積比為1:4混勻作為基礎液，加入自體成纖維細胞，終濃度是1.0×10⁷/ml～2.0×10⁷/ml。

2.一種如權利要求1所述自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法，其特征在于，所述自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法包括以下步驟：

步驟一，人皮膚成纖維細胞分離、培養；

步驟二，自體高濃度膠原蛋白液的制備；

步驟三，自體血小板富集血漿的制備；

步驟四，三聯成纖維細胞注射制劑制備。

3.如權利要求2所述的自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟一具體包括：

(1)標本處理：皮膚標本放于無鈣鎂磷酸緩沖液DPBS瓶中，4℃保存，帶回GMP級實驗室；將取回的標本置于生物安全柜，標本移入平皿內，首先用1×磷酸鹽緩沖液DPBS 5ml浸潤15min，用1ml移液槍吸棄，再用1×DPBS同樣反復沖洗，然后用500u/ml氨芐青霉素和500mg/ml硫酸鏈霉素的1×DPBS溶液中浸泡消毒10min后，用1×DPBS液用力反復沖洗5次，直至標本發白，輕度發脹，在平皿中修剪皮下筋膜，剔除脂肪，將標本剪碎，后面相同；

(2)分離：用1mg/ml的混合膠原酶MNP-S在37℃條件下消化1h，分離表皮與真皮；去除表皮，真皮組織剪成約0.1mm³～0.3mm³大小，加入Tryple select無動物源性消化液，37℃條件下繼續消化15min；當成纖維細胞大部分從組織中分離出來時，加入10％FBS高糖-IMDM培養基終止消化，移入離心管，1000r/min離心5min，收集沉淀；

(3)培養和傳代，將獲得的細胞及剩余的組織塊一并接種于75cm²培養瓶中，加入1ml完全培養基，注意切勿使培養物浮起，置37℃5％CO₂培養箱中培養；于培養24h后補充培養液，此后隔3天半定量換液；原代細胞融合至70％時，Tryple select無動物源性消化液消化，200目過濾去除組織塊，按照1：2比例轉入T175傳代，培養基改為加含10％自體血清培養基；從P2代開始，以1:5的比例傳代，培養至第四代，可獲得2×10⁸～3×10⁸成纖維細胞。

4.如權利要求2所述的自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟二具體包括：自體真皮成纖維細胞在體外培養擴增過程中，分泌膠原蛋白、纖連蛋白，在換液時，將所有含分泌蛋白上清全部收集，放于離心管，采用冷凍濃縮技術濃縮，獲得高濃度膠原蛋白大于1500ug/ml，放于4℃冰箱無菌保存。

5.如權利要求2所述的自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟三具體包括：

(1)將臨床無菌采集的自體靜脈血200ml從采血袋或注射器中移入到離心管中，全血離心450g，10min；

(2)全血分層為無明顯界限的兩層，取上層液體，取到紅細胞層以上的包括白細胞在內的上層部分血漿；

(3)將獲得的血漿3000g離心15min，溫度22℃±2℃，使血小板下沉；

(4)吸出上層少血小板血漿，放于另一無菌離心管中，作為制備培養成纖維細胞培養基的血清，余下5ml～10ml血漿混勻，即為濃縮血小板。

6.如權利要求2所述的自體三聯皮膚成纖維細胞制劑的制備方法，其特征在于，所述四具體包括：將獲得自體三聯、自體膠原濃縮液按照1:4的比例混勻，作為制劑的基礎液，加入成纖維細胞，使制劑的成纖維細胞濃度為1.0×10⁷/ml-2.0×10⁷/ml，PRP中血小板濃度為0.5×10⁹/ml～0.6×10⁹/ml；膠原蛋白濃度為大于1500ug/ml，三位一體，制備成了無菌的三聯成纖維細胞注射液制劑。

7.一種由權利要求1～6任意一項所述自體三聯成纖維細胞注射液制劑制備方法制備的皮膚除皺、抗衰美容制劑。