[發明專利]一種真菌表達載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201710725033.6
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107354168B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 金凱;夏玉先;杜彥茹
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 高彬

本發明涉及一種含有超表達真菌轉錄調控因子Som1的真菌表達載體。所述表達載體為由綠色熒光蛋白基因gfp、超表達真菌轉錄調控因子Som1基因和pBarEx質粒表達載體構成的組成性表達載體。本發明真菌表達載體的構建方法巧妙、選擇劑價格低廉、程序簡單，同時對利用本發明真菌表達載體的昆蟲病原真菌轉基因菌株的篩選程序簡單、篩選效率高，而且不影響真菌的代謝平衡，通過提高單個基因的表達量就可以提高真菌的抗逆能力和毒力，在轉基因真菌研究及市場化過程中具有潛在的、廣泛的應用前景。此外，本發明將為安全、高效的基因工程真菌農藥等提供良好的技術平臺。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種真菌表達載體及其構建方法。

背景技術

據聯合國糧農組織(FAO)統計，世界糧食產量因病蟲草鼠害造成的損失每年大約占總產的20-35％，其中蟲害14％。化學防治目前仍是害蟲防治中的一種重要措施，在保障農業增產方面起著積極作用。然而，化學農藥的廣譜、高毒和難降解等特性引起了一系列的環境和社會問題。隨著人類對生存環境的日益重視，要求減少化學農藥使用量的呼聲越來越高漲，在這種情況下，以生物防治為主的害蟲防治策略正受到廣泛重視。由于微生物生物防治具有安全和可持續控制的優點，一直受到人們的廣泛關注。殺蟲微生物農藥是利用昆蟲病原微生物研制的一大類生物農藥，真菌是昆蟲病原微生物中最大的一個類群，在自然條件下由真菌致病死亡的昆蟲約占全部病原微生物致病死亡的60％，是自然界控制昆蟲種群數量的重要因素之一。與細菌、病毒殺蟲途徑不同，真菌能夠直接從昆蟲體壁侵染昆蟲，真菌可侵染刺吸式口器害蟲、鞘翅目害蟲以及昆蟲的卵和蛹等。同時，真菌殺蟲劑對人和其它脊椎動物沒有危險，也不傷害昆蟲的天敵，對環境的影響很小。目前，已發現殺蟲真菌約有100多屬、800多種，除擔子菌亞門之外，昆蟲病原真菌存在于其它所有真菌亞門中。研究應用的主要種類有白僵菌、綠僵菌、玫煙色擬青霉和蠟蚧輪枝菌在內的十多種真菌。真菌是最先被研制成殺蟲劑的微生物，綠僵菌和白僵菌等殺蟲真菌農藥已用于松毛蟲、玉米螟和蝗蟲等害蟲的防治，其中殺蝗綠僵菌制劑被聯合國糧農組織推薦為環保型產品，國內外已登記60多種殺蟲真菌農藥，目前真菌殺蟲劑已作為化學農藥的替代產品或補充制劑防治多種有害昆蟲。雖然昆蟲病原真菌在防治害蟲方面具有獨特的優勢，但目前真菌殺蟲劑的市場占有率非常低。造成這種情況的主要原因是由于真菌殺蟲劑致病過程較長、殺蟲較慢，受環境因素(溫度、濕度、光照和風雨等)影響大、防效難以穩定。因此，急需提高菌株的綜合性狀，如產孢能力、抗逆能力和毒力等。

目前，利用基因工程手段改良菌株主要集中在提高真菌毒力方面，并已取得有良好進展。組成性表達綠僵菌類枯草桿菌蛋白酶基因(Pr1)的工程菌株毒力明顯提高，致死時間縮短25％，取食量下降40％；組成性表達白僵菌幾丁質酶基因的工程菌株對蚜蟲的毒力明顯增強，對蚜蟲的致死劑量比野生菌株降低50％；由于該基因沒有幾丁質連接域，將家蠶的幾丁質連接域與其融合后，組成性表達的工程菌株殺蟲活性進一步提高。將昆蟲特異性神經毒素AaIT基因置于昆蟲血腔特異啟動子的控制下轉入綠僵菌，工程菌株對煙草天蛾和埃及伊蚊的殺蟲速度分別提高28％和38％，致死中濃度(LC50)分別下降約22倍和9倍，感染昆蟲取食量下降50％；神經毒素只有在真菌穿透昆蟲表皮后才能表達，進一步提高了工程菌株的安全性。

然而，作為生物農藥進入自然環境中，除了殺蟲速度以外，對逆境的耐受能力也直接影響真菌殺蟲劑在田間的防效穩定性。目前，國內外還缺乏利用基因工程手段對殺蟲真菌工程菌株的綜合性狀進行改良的報道。因此，迫切需要開展以基因工程手段進行殺蟲真菌綜合性狀改良的研究，為選育具有實用價值的安全、高毒力的殺蟲真菌工程菌株奠定基礎。

發明內容