[發明專利]一種真菌表達載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201710725033.6
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107354168B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 金凱;夏玉先;杜彥茹
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 高彬

1.一種真菌表達載體，其特征在于，所述表達載體為由綠色熒光蛋白基因gfp、超表達真菌轉錄調控因子Som1基因和pBarEx質粒表達載體構成的組成性表達載體；所述超表達真菌轉錄調控因子Som1基因為綠僵菌MaSoml基因；

所述pBarEx的構建方法為：以構巢曲霉基因組DNA為模板進行擴增；并以pCAMBIA 3300質粒的DNA為模板擴增；以構巢曲霉基因組DNA的上游擴增引物為上游擴增引物、pCAMBIA3300擴增的下游擴增引物為下游擴增引物，采用融合PCR擴增得到Bar Cassette；將載體pAN52-1與除草劑抗性基因Bar基因的表達元件Bar Cassette分別采用AatII與BamHI雙酶切后，用T4連接酶連接構建得到所述pBarEx；

所述構巢曲霉基因組DNA的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述構巢曲霉基因組DNA的下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述pCAMBIA 3300擴增的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，pCAMBIA3300擴增的下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

其中，SEQ ID NO.3與SEQ ID NO.2反向互補。

2.根據權利要求1所述的真菌表達載體，其特征在于，所述表達載體為綠色熒光蛋白基因gfp和超表達真菌轉錄調控因子Som1基因融合后插入pBarEx質粒表達載體中構成的組成性表達載體。

3.根據權利要求1或權利要求2所述的真菌表達載體，其特征在于，用XbaI/BamHI酶切上述真菌超表達載體pBarEx，37℃水浴2小時，將酶切產物進行瓊脂糖電泳，出現6kb左右片段，回收6kb左右的片段；以綠僵菌基因組DNA為模板進行擴增得到MaSom1基因的編碼序列；以質粒pEGFP-C1為模板進行擴增，得到綠色熒光蛋白基因gfp的編碼序列；以上述兩個擴增產物為模板，利用綠僵菌基因組DNA的上游擴增引物和質粒pEGFP-C1的下游擴增引物進行融合PCR擴增得到融合基因MaSom1:gfp，回收擴增產物；T4 DNA Ligase 16℃連接XbaI/BamHI酶切的pBarEx和融合PCR產物MaSom1:gfp 6小時左右，轉化大腸桿菌感受態，涂布于LB平板上，37℃恒溫培養12-16小時，挑取單菌落于液體LB中，37℃250rpm培養12小時，提取質粒DNA，利用XbaI/BamHI酶切提取質粒DNA，切下2.2kb左右的片段，得到pBarEx-Som1:GFP質粒表達載體；

所述綠僵菌基因組DNA的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，綠僵菌基因組DNA的下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述質粒pEGFP-C1的上游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，質粒pEGFP-C1的下游擴增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根據權利要求3所述的真菌表達載體，其特征在于，瓊脂糖電泳過程中，膠質量分數為0.99％。

5.權利要求1-4任一項所述真菌表達載體的構建方法，其特征在于：首先將綠色熒光蛋白基因gfp和超表達真菌轉錄調控因子Som1基因融合得到融合基因Som1:gfp，再將融合基因Som1:gfp插入pBarEx質粒表達載體，構成組成性表達載體。

6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述超表達真菌轉錄調控因子Som1基因采用綠僵菌MaSoml基因，其與綠色熒光蛋白基因gfp進行融合PCR擴增得到融合基因MaSoml:gfp，再將融合基因Som1:gfp插入pBarEx質粒表達載體，構成組成性表達載體；其中融合PCR擴增的模板為MaSoml基因的編碼序列和gfp基因的編碼序列，上游擴增引物如SEQID NO.5所示，下游擴增引物如SEQ ID NO.8所示。