[發明專利]一種循環腫瘤細胞的免疫熒光染色及判讀方法

在審

• 申請號: 201710721836.4
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107402296A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 楊昂;張磊
• 申請（專利權）人: 亞能生物技術（深圳）有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/574;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所44275
• 代理人: 張明

1.一種循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：包括以下步驟：

S10樣本處理：對用磷酸緩沖溶液稀釋后的血液樣品進行離心處理后，除去血液樣品中的紅細胞和白細胞；

S20染色前處理：用磷酸緩沖溶液潤洗所述步驟S10處理后的血液樣品，加入固定液對血液樣品中的細胞進行固定后加入透化液進行透化，再加入封閉液進行充分封閉；

S30免疫染色：向所述步驟S20處理后的血液樣品在暗處滴加anti-pan-CK-FITC染色液、anti CD45-AF594染色液和anti-Vimentin-FITC染色液，避光孵育后棄去上述染色液加入核酸熒光染料繼續孵育。

2.根據權利要求1所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：所述核酸熒光染料為4',6-二脒基-2-苯基吲哚。

3.根據權利要求1所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：所述循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法還包括添加封片劑進行封片處理的步驟。

4.根據權利要求3所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：所述封片劑為抗熒光淬滅劑。

5.根據權利要求3所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：所述封片劑中含有質量濃度百分比為5～10％甘油。

6.根據權利要求1所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：所述步驟S30中，每加入一種染色液后都避光孵育一次。

7.根據權利要求6所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：每次加入染色液后避光孵育的時間為10～45min。

8.根據權利要求6所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：加入核酸熒光染料后繼續孵育的時間為每次加入染色液后避光孵育時間的1/20～1/5。

9.根據權利要求1所述的循環腫瘤細胞的免疫熒光染色方法，其特征在于：包括以下步驟：

S10樣本處理：向淋巴分離管中加入3ml密度梯度分離液，瞬時離心使密度梯度分離液全部轉至管底，按順序分別加入3ml患者外周全血和5ml PBS溶液，于1000g下離心15min；

吸去白膜層及上層廢液，將剩余液體小心倒入離心管中，加入3ml PBS沖洗淋巴管后倒入離心管中，然后于500g離心10min，棄上清；

加入4ml紅細胞裂解液，重懸，使血細胞均勻分散于裂解液中，2～8℃充分裂解8min，裂解過程中至少進行2次顛倒混勻，然后于300g下離心5min，真空抽濾除去上清液；

取出免疫磁珠進行振蕩均勻，再按100μl/樣本的使用量吸取免疫磁珠至離心管中用PBS溶液進行潤洗；

在裂解后的離心管中先加入4ml孵育液重懸，按照100μl/樣本加入免疫磁珠預處理液，置于2～8℃冰箱中的試管旋轉搖床中孵育20min后取出離心管置于磁力架上靜置，將免疫磁珠吸附后剩余的澄清液全部轉移到另一支離心管中，吸取3mlPBS溶液分別沖洗離心管和蓋子3次，每次待磁珠完全被吸附后澄清液全部轉移然后于300g離心5min，抽濾棄去上清液；

S20染色前處理：取上述樣品用1000μl以上PBS溶液至少潤洗1次，每次4min；取1000μl 4％甲醛溶液于通風廚內固定血液樣品中的細胞10min；再用1000μl以上PBS溶液至少潤洗1次，每次4min；用1000μl透化液透化細胞5min；再次用1000μl以上PBS溶液至少潤洗1次，每次4min；用1000μl封閉液封閉30min，之后移除封閉液；

S30免疫染色：用抗體稀釋液稀釋好的500μl anti-CK-FITC抗體加入樣品管內，室溫下避光孵育30min；用1000μl以上PBS溶液至少潤洗1次，每次4min；將用抗體稀釋液稀釋好的500μl anti-Vimentin-FITC抗體加在樣品管內，室溫下避光孵育20min后用1000μl以上PBS溶液至少潤洗1次，每次4min；再將用抗體稀釋液稀釋好的500μl anti-CD45-AF594抗體加在樣品管內，室溫下避光孵育25min后用1000μl以上PBS溶液至少潤洗1次，每次4min；將用稀釋好的200μl DAPI加在樣品管內，室溫下避光孵育2min；

S40封片：移除樣品管內的液體，將樣品全部轉移至黏附載玻片樣品框內，滴加10μl抗熒光淬滅劑進行封片，蓋上蓋玻片。

10.一種對如權利要求1～9任一項所述的染色方法染色后的血液樣品的判讀方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1掃描觀察：將染色后的血液樣品置于熒光顯微鏡下觀察不同通道的熒光，通過Z形掃描法對樣品進行掃描，觀察各細胞的熒光顯色情況；

S2結果判定：若所述核酸熒光染料通道顯色，anti-pan-CK-FITC通道可見綠色熒光或anti-Vimentin-FITC通道可見綠色熒光，anti-CD45-AF594通道不可見紅色熒光，則該細胞為循環腫瘤細胞；

其中，所述判讀方法的結果判定以非治療為目的。