[發明專利]一種循環腫瘤細胞的免疫熒光染色及判讀方法

在審

• 申請號: 201710721836.4
• 申請日: 2017-08-22
• 公開（公告）號: CN107402296A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 楊昂;張磊
• 申請（專利權）人: 亞能生物技術（深圳）有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/574;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所44275
• 代理人: 張明

技術領域

本發明屬于體外診斷技術領域，涉及腫瘤細胞的鑒定，具體涉及一種循環腫瘤細胞的免疫熒光染色及判讀方法。

背景技術

據世界衛生組織發布的《2014年世界癌癥報告》稱，腫瘤已經成為全世界人類最大致死原因，惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康和社會經濟發展的重大公共健康問題。根據流行病學調查結果顯示，肺癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、結直腸癌等惡性腫瘤的發病率和死亡率位居前列，2012年全世界共新增1400萬癌癥病例并有820萬人死亡。早在2006年，世界衛生組織就提出了“早期發現、早期診斷、早期治療”腫瘤防治的黃金三原則。也因此，考慮到腫瘤診斷技術在腫瘤早期診斷、腫瘤監測、預后判斷等方面具有重要的臨床意義，過去幾十年間許多學者針對腫瘤診斷技術進行了大量的研究。

傳統腫瘤診斷手段包括：影像學檢查、腫瘤標志物檢查、病理學檢查等，但這些診斷手段各有局限性，比如影像學反應的腫瘤大小與腫瘤的惡性程度及侵犯能力不一致；基于血清腫瘤標記物的免疫、生物化學檢驗因腫瘤的生物標志物在人群中表達的巨大差異、靈敏性和可靠性較低等因素，到目前為止，血清腫瘤標志物檢查仍無法保證對腫瘤的有效診斷；病理學檢查需要手術或者穿刺活檢，一方面技術要求較高，另一方面無論手術或者穿刺均為有創操作，無法反復多次、長期或隨時獲取。由于傳統腫瘤診斷方法遠遠不能滿足臨床需求，所以現代臨床醫學迫切需要新的診斷方法。在此背景下，循環腫瘤細胞(Circμlating Tumor Cells，CTC)技術逐步興起。從而起到腫瘤早期診斷、指導個體化治療方案選擇、實時藥物療效監測、指導預后判斷、預警復發、預警耐藥、個體化藥物選擇等作用。

循環腫瘤細胞是指自發或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的一類腫瘤細胞的統稱。隨著原位腫瘤的不斷生長、增大，部分腫瘤細胞可以通過分泌一種抑制黏附因子表達的物質，增加其運動能力并促使其與母體脫離。這些脫落中的腫瘤細胞再分泌一種蛋白溶解酶，例如基質金屬蛋白酶MMPs，降解細胞外基質和基底膜，破壞周邊宿主結締組織并進入脈管系統，增強癌細胞浸潤能力，通過血液循環進行全身性的轉移。循環腫瘤細胞即是指這一類由實體瘤或轉移灶釋放或脫落的腫瘤細胞通過上皮-間質轉化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)，增強其流動性和侵襲性而進入外周血循環的腫瘤細胞。其具有血液分布極少、不同來源CTC表面抗原表達不同具有抗原異質性、不同于腫瘤細胞的常規形態、經歷過EMT過程有更強的侵襲性和轉移性、不同的CTC具有不同的拷貝數變異等特點，而且由于CTC與原發病灶腫瘤組織具有高度的一致性，所以其能夠代表原發腫瘤的表性和遺傳組成，并能夠作為任何轉移性腫瘤的“液體活檢”。但是血液中循環腫瘤細胞通常以極低的數量存在于血液中，約1～10個/ml，僅占外周血白細胞的1/10⁶～1/10⁷，而正常成人外周血中細胞種類繁多，其中血細胞濃度為10⁹/ml，白細胞的濃度是4～10×10⁶/ml。目前，雖然已經針對循環腫瘤細胞的分離已經開發出了各種各樣的分離手段，諸如密度梯度離心法、濾膜過濾法、免疫磁珠法和微流控芯片法等，但是局于當前技術手段的限制均不能獲得完整、純凈的循環腫瘤細胞，以致于在后續的分析中如何判別目的細胞就顯得尤為重要。