[發明專利]一種樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法

有效

• 申請號: 201710715979.4
• 申請日: 2017-08-21
• 公開（公告）號: CN107475198B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 代解杰;李娟;曾曉鋒;罕園園;李楨;仝品芬;楊根夢;孫曉梅;王文廣;陸彩霞;匡德宣;李娜
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所;昆明醫科大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

1.一種樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），將3日齡內的離體樹鼩大腦放入4℃的含體積濃度為2%雙抗的D-Hank's液中，去除軟膜血管，剝離出大腦皮質及中腦組織，用D-Hank's液清洗后，將組織剪碎至0.9~1.1mm大小，離心，棄上清，按照體積1:3比例加入0.25%胰酶消化液，于細胞培養瓶中，反復吹打并于37℃、5%CO₂條件下消化15~20分鐘；離心速度為2500~3000轉/分，離心時間5~10分鐘；

步驟（2），待步驟（1）消化結束后，向細胞培養瓶中加入細胞培養液終止消化，反復吹打消化后的細胞直至無肉眼可見的組織塊，之后采用70目細胞篩過濾，濾液離心，棄上清，用神經元專用培養基重懸細胞并轉入0.1mg/ml PDL包被的細胞板上培養，細胞板中細胞含量為1×10⁶cell/孔，培養3d后換液，更換為新的神經元專用培養基，以后每3天換一次液，得到樹鼩多巴胺能神經元細胞，當細胞貼壁并長至匯合度為70%-80%時，進行酪氨酸羥化酶及Nestin蛋白的雙熒光免疫鑒定；離心速度為2500~3000轉/分，離心時間10~15分鐘；

所述的細胞培養液為高糖DMEM細胞培養基+ 5%FBS+1%雙抗；

所述的神經元專用培養基為neurbasal培養基+ 2%B27+1%Glutamax^TM+ 1%雙抗。

2.根據權利要求1所述的樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法，其特征在于，步驟（1）中，采用眼科剪將組織剪碎。