[發明專利]一種樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法

有效

• 申請號: 201710715979.4
• 申請日: 2017-08-21
• 公開（公告）號: CN107475198B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 代解杰;李娟;曾曉鋒;罕園園;李楨;仝品芬;楊根夢;孫曉梅;王文廣;陸彩霞;匡德宣;李娜
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所;昆明醫科大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

本發明涉及一種樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法，屬于細胞分離培養技術領域。本發明將3日齡內的離體樹鼩大腦放入預冷的含2%雙抗的D?Hank's液中，去除軟膜血管，剝離出大腦皮質及中腦組織，用D?Hank's液清洗后，剪碎，離心，棄上清，胰酶消化后，過細胞篩，濾液離心，棄上清，用神經元專用培養基重懸細胞，轉入PDL包被的細胞板上培養，培養3d后換液，以后每3天換一次液；當細胞貼壁并長至70%?80%時，進行酪氨酸羥化酶及Nestin蛋白的雙熒光免疫鑒定。利用本方法分離培養出的神經元細胞成活率高達95%，能為進一步的神經系統疾病的研究提供可靠的實驗材料。

技術領域

本發明屬于細胞分離培養技術領域，具體涉及一種樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法。

背景技術

神經細胞不具有再生功能，但神經元細胞可以自我更新，能夠促進神經細胞再生和神經組織修復，目前神經元細胞難以分離培養。神經性疾病如帕金森綜合征、毒品依賴性疾病等會作用于多巴胺能神經細胞，因此找到一種高效分離培養及鑒定多巴胺能神經元細胞的方法是非常必要的。樹鼩是一種新型的模式動物，全基因組研究發現它的代謝、神經及免疫系統與人類有著較為高度的同源性，是研究神經系統疾病較好的模型。本發明選用新生樹鼩為動物模型，分離培養出具有多巴胺能神經元活性的細胞，從而為進一步的神經系統疾病的研究奠定基礎。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法，該方法利用胰酶消化法分離樹鼩神經元細胞，細胞活性較高，能夠分離出多巴胺能神經元，為進一步的神經系統疾病的研究奠定基礎。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種樹鼩多巴胺能神經元細胞分離培養方法，包括如下步驟：

步驟（1），將3日齡內的離體樹鼩大腦放入4℃的含體積濃度為2%雙抗的D-Hank's液中，去除軟膜血管，剝離出大腦皮質及中腦組織，用D-Hank's液清洗后，將組織剪碎至0.9~1.1mm大小，離心，棄上清，按照體積1:3比例加入0.25%胰酶消化液（即離心管中剩余物與0.25%胰酶消化液的體積比為1:3），于細胞培養瓶中，反復吹打并于37℃、5%CO₂條件下消化；

步驟（2），待步驟（1）消化結束后，向細胞培養瓶中加入細胞培養液終止消化，反復吹打消化后的細胞直至無肉眼可見的組織塊，之后采用70目細胞篩過濾，濾液離心，棄上清，用神經元專用培養基重懸細胞并轉入0.1mg/ml PDL包被的細胞板上培養，細胞板中細胞含量為1×10⁶cell/孔，培養3d后換液，更換為新的神經元專用培養基，以后每3天換一次液，得到樹鼩多巴胺能神經元細胞；當細胞貼壁并長至匯合度為70%-80%時，進行酪氨酸羥化酶及Nestin蛋白的雙熒光免疫鑒定；

所述的細胞培養液為高糖DMEM細胞培養基+5%FBS+1%雙抗；

所述的神經元專用培養基為neurbasal培養基+ 2%B27+1%Glutamax^TM+ 1%雙抗。

進一步，優選的是，步驟（1）所述的離心速度為2500~3000轉/分，離心時間5~10分鐘；

進一步，優選的是，步驟（1）中，采用眼科剪將組織剪碎；

進一步，優選的是，步驟（1）中，所述的消化的消化時間15~20分鐘；

進一步，優選的是，步驟（2）所述的離心速度為2500~3000轉/分，離心時間10~15分鐘。

利用本發明方法，神經元細胞分離1天后貼壁生長，7天后經免疫雙熒光鑒定為具有多巴胺能活性的神經元細胞。

本發明利用胰酶消化法分離樹鼩神經元細胞，細胞活性較高，能夠分離出多巴胺能神經元。