[發明專利]一種哺乳動物胚胎細胞的培養方法

有效

• 申請號: 201710707664.5
• 申請日: 2017-08-17
• 公開（公告）號: CN107365739B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 羅擎英;劉蜀坤;黎杉珊;劉耀文;張志清;申光輝;吳賀君;陳安均;劉興艷;李美良;蘇趙
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 于鵬

本發明提供了一種哺乳動物胚胎細胞的培養方法，其在培養時，不加入哺乳動物自身的孕期子宮胎液，且將培養分為兩個階段，兩個階段的培養時間及其培養基配方不同。本發明的培養方法適用于多種哺乳動物的胚胎細胞培養，且均具有較高的卵裂率、融合率和囊胚率。本發明的培養方法得到的胚胎，進行直接移植后，出生率高。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種哺乳動物胚胎細胞的培養方法。

背景技術

隨著胚胎工程技術的發展，胚胎培養液的研究變得日益重要。目前，在動物胚胎培養中，已有的合成培養液(如TCM199或mTCM199)中含有高濃度的葡萄糖，其對于早期胚胎具有一定的毒性。因此，許多研究者采用添加血清、氨基酸、生長因子的方式對培養液進行改良。

在小鼠胚胎培養方面，較為成熟的是KSOM培養液，其獲得了相對較高的囊胚形成率和卵裂球數。

不過，人們發現，單一的培養液并不能獲得令人十分滿意的效果。因此，針對體外培養胚胎在不同發育階段對不同物質需求和代謝的不同而分階段進行培養，成為一個研究熱點。對此，Gardner在其論文“Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluidand their effects on embryo development and metabolism in vitro”和“Cultureand transfer of human blastocysts increases implantation rates and reducesthe need for multiple embryo transfers”進行過有益的嘗試。

中國專利CN 103333855 A也在這個方向進行了研究，其通過在培養液中加入孕期子宮胎液，并進行三個階段的培養，獲得了較好的羊胚胎培養效果。不過，該方法依賴于孕期子宮胎液的提取，這在控制成本上是不利的，而且子宮胎液在提取過程中受多種因素干擾，難以保證獲得的子宮胎液品質的穩定性。

然而，從目前的研究來看，已有的胚胎培養液及其培養方法的適用范圍是及其有限的。通過對CN 103333855 A中的培養方法進行研究，其在其它哺乳動物(如狗和牛)的胚胎細胞的培養上的效果較差。可能的原因在于，雖然孕期子宮胎液的加入在一定程度上提高了培養效果，但培養液中的其它物質才是決定最終培養效果的關鍵，而針對于不同的胚胎細胞而言，所需的培養液成分的差異可能是巨大的。

發明內容

針對現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種哺乳動物胚胎細胞的培養方法，其在培養時，不加入哺乳動物自身的孕期子宮胎液，且培養分為兩個階段，第一階段為：

將哺乳動物胚胎細胞置于第一培養基中進行培養5～6小時；第一培養基的配方，按重量份計為：

葡萄糖0.4～0.6份、乳酸鈉3.0～3.3份、磷酸二氫鉀0.10～0.12份、碳酸氫鈉1.9～2.2份、透明質酸糖胺多糖3.2～3.3份、檸檬酸鈣0.8～0.9份、IGFⅡ0.1～0.2份、牛磺酸0.3～0.9份、二水氯化鈣0.2～0.3份；

所述第一培養基在配制時，除上述成分外，加入水將重量份補足至100份；

第二階段為：

第一階段結束后，移除第一培養基，轉至第二培養基中培養3.0～3.5小時；第二培養基的配方，按重量份計為：

葡萄糖0.4～0.6份、乳酸鈉3.0～3.3份、磷酸二氫鉀0.10～0.12份、碳酸氫鈉1.9～2.2份、丙氨酰谷氨酰胺1.9～2.5份、丙酮酸0.1～0.3份、EGF 0.1～0.2份、胰島素0.01～0.05份，牛磺酸0.3～0.9份、二水氯化鈣0.2～0.3份；

所述第二培養基在配制時，除上述成分外，加入水將重量份補足至100份。

所述哺乳動物為牛、羊、狗中的一種。