[發明專利]基于RT-PCR和RFLP技術鑒別雞傳染性法氏囊病病毒強弱毒株的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710703618.8
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN107475445B
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 唐麗杰;周晗;王麗;徐義剛;李一經;韓冰;林慶宇
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/683;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.基于RT-PCR和RFLP技術鑒別雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株和弱毒株的試劑盒，其特征在于含有用于擴增雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因的引物對以及SpeI、SacI和StuI限制性內切酶，所述的用于擴增雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因的引物對的序列如下所示：

PAU：5’ATCTTGGGTATGTGAGGCTG 3’；

PAD：5’TATGGCCCGGATTATGTCTT 3’。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于還包含rTaq酶、10×PCR緩沖液、dNTP、RNA酶抑制劑、反轉錄酶、5×RT緩沖液以及酶切緩沖液。

3.一種基于RT-PCR和RFLP技術鑒別雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株和弱毒株的方法，所述的方法用于非疾病診斷目的，其特征在于按照以下方法進行：

(1)對待檢測的雞傳染性法氏囊病病毒進行RNA的提取以及反轉錄，獲得病毒cDNA；

(2)PCR擴增；

以步驟(1)獲得的cDNA為模板，以權利要求1中所述的PAU、PAD為上下游引物，PCR擴增VP2序列中的目的基因片段，反應體系如下：cDNA 4μL、rTaq酶0.5μL、10×PCR緩沖液2.5μL、dNTP 3μL、引物PAU 1μL、引物PAD 1μL、去離子水13μL、總體積25μL；

樣品混勻后瞬離，放入PCR儀中，擴增程序如下所示：95℃5min；94℃30sec，57.1℃45sec，72℃50sec，30循環；72℃10min；4℃保存；

(3)病毒目的基因序列PCR產物的回收與純化

將步驟(2)的PCR產物進行純化回收，收集到的DNA保存于-20℃；

(4)RFLP鑒定IBDV毒株

用SpeI、SacI和StuI三種限制性內切酶分別對步驟(3)得到的PCR純化產物進行酶切鑒定；酶切體系如下：10U/uL的SpeI或StuI或SacI 1μL、酶切緩沖液2μL、20～40ng/μL的PCR純化產物7μL、去離子水10μL，總體積20μL；

混勻放入37℃水浴鍋中水浴2h后，與2uL 10×Loading Buffer混勻，以0.8％瓊脂糖凝膠經110V電泳20min，觀察酶切結果；

(5)結果判定

若被SpeI切出531bp和302bp的兩段片段，被StuI切出242bp和591bp的兩段片段，而不能被SacI酶切，則判定為超強毒株；

若只可被SacI切出218bp和615bp的兩段片段，而不能被SpeI以及StuI酶切，則判定為弱毒株。

4.權利要求1或2所述的試劑盒在制備鑒別雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株和弱毒株試劑中的用途。