[發(fā)明專利]一種同時分離尿源性干細胞兩種亞群的培養(yǎng)基、分離方法及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710703587.6
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN107254432B
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設計）人: 解慧琪;陳安靜;皮晉魁;黃益洲
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 張娟;劉華玲

1.一種同時分離人長梭形和谷粒狀尿源性干細胞亞群的培養(yǎng)基，其特征在于，它是由K-SFM培養(yǎng)基 和祖細胞培養(yǎng)基等體積混合而成，

其中，祖細胞培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基和添加因子組成，基礎培養(yǎng)基由60～78％的DMEM高糖培養(yǎng)基、14～30％的Ham’s F12培養(yǎng)基、8～15％FBS組成，添加因子及在祖細胞培養(yǎng)基中的終濃度分別為EGF 4～6 ng/mL、牛垂體提取物4～6 ng/mL、氫化可的松0.3～0.5μg/mL、轉鐵蛋白4～6μg/mL、牛胰島素4～6ng/mL、腺嘌呤1.4～2.2×10^-4M和3,3,5-Triiodo-L-thyromine 1.6～2.4×10^-9M。

2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于：所述基礎培養(yǎng)基由67.5％的DMEM高糖培養(yǎng)基、22.5％的Ham’s F12培養(yǎng)基、10％FBS組成，添加因子及在祖細胞培養(yǎng)基中的終濃度分別為EGF 5ng/mL、牛垂體提取物5ng/mL、氫化可的松0.4μg/mL、轉鐵蛋白5μg/mL、牛胰島素5ng/mL、腺嘌呤1.8×10^-4M和3,3,5-Triiodo-L-thyromine 2×10^-9M。

3.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于：所述牛垂體提取物購自Sciencell公司。

4.權利要求1-3任意一項所述的培養(yǎng)基在分離培養(yǎng)人尿源性干細胞中的用途；

所述人尿源性干細胞為長梭形和谷粒狀尿源性干細胞亞群。

5.一種人長梭形和谷粒狀尿源性干細胞亞群的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：它包括如下步驟：

a、取人尿液，離心，棄上清，用PBS洗滌；

b、加入權利要求1-3任意一項所述的培養(yǎng)基，重懸，貼壁培養(yǎng)；

c、換液，待細胞單克隆生長至直徑0.5-2cm時，采用單克隆消化法分離單個細胞，培養(yǎng)；

d、對細胞進行鑒定，即可。

6.根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟a中，所述離心為400g離心10min。

7.根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟a中，所述PBS洗滌的方法為：加入PBS溶液混勻，400g，離心5min；重復洗滌2次。

8.根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟c后，還包括消化傳代步驟：取細胞進行胰酶消化傳代，培養(yǎng)至第三代細胞。

9.根據(jù)權利要求5-8任意一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述培 養(yǎng)是在溫度為37℃、體積分數(shù)為5％的CO₂的培養(yǎng)箱中進行。