[發明專利]一種基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710702395.3
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN107446924B
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 汪祖鵬;劉義飛;黃宏文;李大衛;張瓊
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N1/21;C12N15/66;C12N9/22;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 44001 廣州科粵專利商標代理有限公司
• 代理人: 劉明星

本發明公開了一種基于CRISPR?Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體及其構建方法和應用。本發明建立的基于CRISPR?Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體能夠快速簡單地對獼猴桃基因進行高效的定點突變，彌補了獼猴桃中基因定點編輯技術的空白。實驗結果證明：通過農桿菌介導的獼猴桃遺傳轉化，本發明的基于CRISPR?Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體成功地對獼猴桃基因AcPDS的兩個靶點進行了定點突變，同時引起了白化的表型。

技術領域：

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因編輯載體及其構建方法和應用。

背景技術：

創建突變體是基因功能研究和作物遺傳改良的最為關鍵的步驟。傳統的誘導基因突變的方法包括隨機誘變、T-DNA/轉座子插入。近些年發展出來的位點特異性的核酸酶，包括鋅指結構(ZFs)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)成功地誘導了定點突變，傳統的誘變方式盲目性高、耗時耗力而且效率非常低。同時由于鋅指核糖核酸酶(ZFN)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)都需要針對特定的基因重新設計對應的內切酶最后與FokI內切酶進行融合，這個構建過程非常繁瑣同時費用非常高。相比較而言，最近建立的定點突變的體系CRISPR-Cas9設計簡單、效率高、費用低、應用范圍廣，已經廣泛應用于多個物種的定點突變。

CRISPR-Cas系統是來源于細菌和古細菌的獲得性免疫系統，主要用于清除噬菌體等外源DNA。該系統主要包括兩個成分crRNA和Cas蛋白，crRNA和Cas蛋白形成有功能的復合物，復合物識別靶標序列下游的PAM序列并切開特異的位點。目前CRISPR-Cas系統可以分為6大類，其中II型系統僅需要一個Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA就可以發揮定點切割的功能。相關研究表明可以用一條人工合成的sgRNA來替代crRNA和tracrRNA，這樣就進一步簡化了該系統，同時成功將該系統用于植物的定點基因編輯。近幾年，該系統已經成功被應用于擬南芥、水稻、煙草、高粱、玉米等，但是目前CRISPR-Cas9系統在獼猴桃上的研究與應用仍是一邊空白。

獼猴桃營養豐富、富含維生素C、經濟價值高，已逐漸成為一種重要的經濟作物。為了更好的研究基因功能和遺傳改良，需要準確的建立定點突變的基因突變株系，目前尚無關于獼猴桃的定點突變的系統，因此建立高效的針對獼猴桃的CRISPR/Cas9系統并將其應用于獼猴桃的基因編輯顯得尤為重要。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體及其構建方法和應用。

本發明的第一個目的是提供一種靶向獼猴桃基因AcPDS的sgRNA表達盒，其特征在于，所述的sgRNA表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本發明的第二個目的是提供一種基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體，其特征在于，包括載體pYLCRISPR/Cas9P-35S-N片段和通過無縫克隆插入到載體pYLCRISPR/Cas9P-35S-N的AscI酶切位點的上述的sgRNA表達盒。

本發明的第三個目的是提供一種含有上述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體的細菌。

所述的細菌優選為農桿菌EHA105。

本發明的第四個目的是提供一種獼猴桃基因AcPDS定點突變試劑盒，其特征在于，包含上述的靶向獼猴桃基因AcPDS的sgRNA表達盒或上述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體或上述的細菌。

本發明的第五個目的是提供一種含有上述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體的轉化體。

本發明的第六個目的是提供一種上述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：