[發明專利]一種基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710702395.3
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN107446924B
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 汪祖鵬;劉義飛;黃宏文;李大衛;張瓊
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N1/21;C12N15/66;C12N9/22;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 44001 廣州科粵專利商標代理有限公司
• 代理人: 劉明星

1.一種靶向獼猴桃基因AcPDS的sgRNA表達盒，其特征在于，所述的sgRNA表達盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一種基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體，其特征在于，包括載體pYLCRISPR/Cas9P-35S-N片段和通過無縫克隆插入到載體pYLCRISPR/Cas9P-35S-N的AscI酶切位點的權利要求1所述的sgRNA表達盒。

3.一種含有權利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體的細菌。

4.根據權利要求3所述的細菌，其特征在于，所述的細菌為農桿菌EHA105。

5.一種獼猴桃基因AcPDS定點突變試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的靶向獼猴桃基因AcPDS的sgRNA表達盒或權利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體或權利要求3所述的細菌。

6.一種權利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以質粒pYLsgRNA-AtU6-1為模板，以引物U6-1-F和U6-1-C作為引物進行PCR擴增，得到含有兩個BsaI酶切位點和AtU6-1啟動子的片段一；

(2)以質粒pYLsgRNA-AtU6-1為模板，以引物GF和GR作為引物進行PCR擴增，得到含有兩個BsaI酶切位點、gRNA scaffold和終止子的片段二；

(3)使用AscI單酶切質粒pYLCRISPR/Cas9P-35S-N，回收后得到線性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N；

(4)將步驟(1)得到的片段一和步驟(2)得到的片段二與線性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N混合后進行同源重組反應，得到質粒pHLW-gRNA-Cas9-U6-1；

(5)根據獼猴桃基因AcPDS的序列，設計靶標序列對應的引物crispr-gRNA1-F和crispr-gRNA2-R；

(6)以質粒pYLsgRNA-AtU6-1為模板，以引物crispr-gRNA1-F和crispr-gRNA2-R作為引物進行PCR擴增，回收并純化得到兩端帶有BsaI酶切位點、同時含有兩個靶標序列的片段三；

(7)將步驟(6)得到的片段三和載體pHLW-gRNA-Cas9-U6-1混合，使用BsaI限制性內切酶和T4 DNA連接酶進行循環酶切連接反應，得到基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體；

所述的步驟(1)、(2)和(6)中使用的引物序列如下：

U6-1-F：5’-GACCGGTAAGGCGCGAGAAATCTCAAAATTCCGGCAGAACAA-3’；

U6-1-C：5’-CGAGACCGGTCTCTAATCACTACTTCGTCTCTAACCATATAT-3’；

GF：5’-AGAGACCGGTCTCGGTTTCAGAGCTATGCTGGAAACAGC-3’；

GR：5’-AGCTCGAGAGGCGCGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGAT-3’；

crispr-gRNA1-F：5’-GGTCTCTGATTCAGGTCTGTCCCATCAAGATGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’；

crispr-gRNA2-R：5’-GGTCTCTAAACCTAAGCCAGTATCAGACTCCAATCACTACTTCGTCTCTA-3’。

7.一種獼猴桃基因AcPDS定點突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：將權利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體電轉化農桿菌EHA105感受態細胞，篩選陽性克隆，然后侵染獼猴桃葉片，以侵染后的獼猴桃葉片為外植體進行植物組織培養，經抗性篩選，抗性愈傷組織分化再生，用PCR和TA克隆測序驗證，確認獲得轉基因獼猴桃。

8.權利要求1所述的靶向獼猴桃基因AcPDS的sgRNA表達盒或權利要求2所述的基于CRISPR-Cas9的獼猴桃基因AcPDS編輯載體或權利要求3所述的細菌或權利要求5所述的獼猴桃基因AcPDS定點突變試劑盒在獼猴桃基因AcPDS定點突變中的應用。