[發明專利]一種檢測微囊藻毒素MC-LR時間分辨熒光免疫定量POCT試紙條

在審

• 申請號: 201710699013.6
• 申請日: 2017-08-16
• 公開（公告）號: CN109406784A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 汪勁能
• 申請（專利權）人: 上海雄圖生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于時間分辨免疫檢測領域，根據時間分辨熒光免疫層析技術和POCT理念開發了一種檢測微囊藻毒素MC?LR時間分辨熒光免疫定量POCT試紙條。本發明試紙條先用銪(Eu)熒光微球標記抗體，然后將其固定于結合墊上，再將抗原固定于NC膜上，37℃烘干，最后將樣品墊、熒光微球結合物墊、NC膜和吸水墊依次搭接于PVC板上，切成4mm寬的試紙條，轉入PVC卡殼，卡殼上設有與樣品墊相配合的加樣孔，和與檢測T線和質控C線相配合的讀數窗口。本發明試紙條采用競爭免疫反應的檢測原理，將試紙條插入時間分辨熒光免疫定量POCT分析儀，可實現方便快捷、低成本、高靈敏的定量檢測水體及水產品中微囊藻毒素(MC?LR)的含量，整個檢測過程僅需5min，檢測限0.05ppb，定量線性范圍為 0?10ppb。

技術領域

本發明屬于時間分辨免疫檢測領域，尤其是一種水體及水產品中快速定量檢測微囊藻毒素技術領域。

背景技術

隨著全球水體富營養化程度加劇，藍藻水華和赤潮的發生逐漸增加，由此產生的代謝產物微囊藻毒素（Microcystins, MCs），對水體環境和人類健康的危害己成為全球關注的重大環境問題之一。微囊藻毒素(MC)是一種細胞內毒素，當藻類死亡后其細胞破裂釋放出毒素，結構為環狀七肽化合物，相對分子質量在1000 左右，至今發現的MC異構體中，毒性最大的是MC-LR，對動物和人有強烈的肝毒性。微囊藻水華在全球淡水水體中發生頻率最高、范圍最廣、持續時間長且危害最大，浮游動物和魚類對微囊藻毒素有較大的耐受性,毒素常可在其體內富集和存留，并達到相當高的濃度，由于微囊藻毒素具熱穩定性和水溶性，普通的食物烹調過程不能除去，因此微囊藻毒素還可通過食物鏈對人類造成潛在的健康威脅。1998年，世界衛生組織（WHO）出版的《用水衛生基準》中建議飲用水中 MC-LR安全標準為1.0μ g/L，我國2006年在頒布的《用水衛生標準》（GB5749-2006 ）中增加了微囊藻毒素MC-LR 的檢測指標和限量標準，規定其限量值為1.0 μg/L。

目前MC-LR的檢測方法有生物毒理檢測法、蛋白磷酸酶抑制分析法(PPIA)、酶聯免疫分析法(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)、液相色譜/質譜分析(LC-MS)等。生物毒理檢測由于費用高、動物保護等限制己很少使用；蛋白磷酸酶抑制法選擇性較差，結果不夠準確，實際應用受到了很大限制；免疫分析法是基于抗原-抗體特異性反應的分析方法，具有特異性強、靈敏度高、檢測速度快、費用低廉等特點，是目前比較常用的檢測方法，包括酶聯免疫吸附法 (ELISA）、膠體金快速檢測法等，但也均存在各自的優缺點，酶聯免疫吸附法雖然結果準確，但操作簡便性欠佳，需要多次孵育和洗滌，操作繁瑣，耗時長，至少1.5小時才能檢測出結果；膠體金法檢測快速，但靈敏度較低，且只能實現定性或半定量檢測，無法給出定量的檢測結果；高效液相色譜(HPLC)、液相色譜/質譜分析(LC-MS)，可以對微囊藻毒素進行定量的分析測定，結果可靠，但色譜法所使用的儀器價格昂貴，需要專業人員進行操作，前處理復雜，分析周期長，成本高，也無法滿足大量樣品的篩選和實時檢測的需要。

發明內容

為了克服上述檢測缺點，本發明根據時間分辨熒光免疫層析技術和POCT的理念開發了一種檢測微囊藻毒素MC-LR時間分辨熒光免疫定量POCT試紙條。POCT ( point-of-care testing)是醫學檢驗的一種新模式，2004年POCT概念引入中國，開始在醫學檢驗上使用，2013年國家標準化委員會將POCT正式命名為即時檢驗，即可以不受樣品多少，場地限制實時檢測。本發明使用鑭系元素銪(Eu)熒光微球標記抗體，根據其發光特點和光譜特性，用時間分辨技術測量發射熒光，通過時間延遲和波長分辨，有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。本發明試紙條采用競爭免疫反應的原理，僅配合一臺時間分辨熒光免疫定量POCT分析儀，可實現方便快捷、低成本、高靈敏的定量檢測水體及水產品中微囊藻毒素(MC-LR)的含量，檢測時間僅需 5分鐘，可滿足當前實時快速監測現場飲用水的安全和大規模的水體及水產品中微囊藻毒素(MC-LR)的檢測，具有重要的經濟價值和社會效益。