[發明專利]一種新型耐葡萄糖的β?葡萄糖苷酶基因及其應用

在審

• 申請號: 201710698739.8
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107828806A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 李荷;張雪玲;夏玉林
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/22
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司44259
• 代理人: 姚迎新

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因及編碼產物，尤其利用宏基因組文庫篩選的方法從黑龍江玉米土壤微生物中獲得一種新型β-葡萄糖苷酶基因及編碼產物。

背景技術

β-葡萄糖苷酶(分類學編號為EC 3.2.1.21)，又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，是三種纖維素酶之一，能夠水解烴基或芳香基與糖基之間的糖苷鍵生成葡萄糖，屬于糖苷水解酶家族，在纖維素降解中起決定性作用。β-葡萄糖苷酶在工業上有著廣泛的應用，食品行業應用于改良食品風味；醫藥行業應用于轉化白藜蘆醇苷及大豆異黃酮糖苷化合物、制備低聚龍膽糖、疾病的檢測和藥物的研制等；生物能源行業降解纖維素生產生物乙醇；在紡織、造紙行業也廣泛使用β-葡萄糖苷酶。深入開展β-葡萄糖苷酶的研究具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。

目前工業上應用的β-葡萄糖苷酶絕大部分來自木霉等真菌，對溫度和pH等條件適應范圍較窄，而且酶活力也偏低，導致發酵生產和使用成本較高，這已成為當前β-葡萄糖苷酶廣泛應用的瓶頸。因此，如何從各種自然生境中尤其是極端環境中篩選具有耐高溫、耐酸堿、耐有機溶劑、高酶活、底物廣等酶學性質優良的新型β-葡萄糖苷酶，是當前在β-葡萄糖苷酶研究中面臨的一項重要任務。

自然界中存在的微生物99％是不可培養的，因此從用傳統的培養技術分離到的微生物中篩選新的生物催化劑的方法是非常有局限性的。利用免培養技術-宏基因組技術(Metagenomics)，直接從環境中提取DNA，將其克隆到不同的載體中，構建宏基因組文庫，再從中進行篩選。該技術在挖掘和利用未培養微生物資源和篩選新穎生物活性物質方面表現出巨大的潛力，已成為當前國際上微生物學研究的前沿領域和熱點。至今國內外學者已經通過該技術克隆到如淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、酯酶等新基因，這些酶具有新穎的酶學特性及工業應用潛力。因此該方法為發現β-葡萄糖苷酶基因提供了新思路。

中藥材虎杖作為我國的傳統中藥具有祛風利濕、止咳化痰、活血止痛的藥理作用。白藜蘆醇是虎杖中的活性成分之一，能夠降低血脂的濃度，抑制血小板的聚集，防止心血管疾病的發生；還能夠作用于癌癥發生的各個階段，抑制腫瘤細胞的活動，可以治療多種腫瘤疾病。此外白藜蘆醇還具有抗炎、抗氧化等作用，發揮解熱和止痛等療效，使之成為近年來的研究熱點。但是在植物中白藜蘆醇絕大多數是與葡萄糖結合在一起，形成白藜蘆醇苷，這部分白藜蘆醇在人體內是不能被利用的。在目前已知的植物中白藜蘆醇在虎杖中的含量是最高的，但是也僅占0.2％－0.4％，這就是說即使虎杖中游離的白藜蘆醇完全被提取出來，100千克虎杖也只能得到最多0.4千克的白藜蘆醇，遠遠不能滿足市場的需求。但是如果虎杖中1.5％–3.0％的白藜蘆醇苷在體外水解成白藜蘆醇，將極大程度上提高白藜蘆醇的產生率。白藜蘆醇苷屬于β-糖苷類，可以在β-葡萄糖苷酶的作用下水解為白藜蘆醇。因此高效且穩定性好的β-葡萄糖苷酶是虎杖中白藜蘆醇苷水解的關鍵。但是目前市面上的β-葡萄糖苷酶主要來自于木霉、曲霉等真菌，酶活力低且溫度和pH等穩定性范圍較窄，導致β-葡萄糖苷酶的價格昂貴，不利于虎杖中白藜蘆醇苷水解的工業化生產。本發明用重組β-葡萄糖苷酶水解虎杖中的白藜蘆醇苷可以避免以上的問題。

發明內容

本發明的第一個目的在于解決現有技術的不足之處并提供一種新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因命名為bgl2238。

本發明的第二個目的在于提供新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因的制備方法。

本發明的第三個目的在于提供一種新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因的重組質粒pET32a-bgl2238。

本發明的第四個目的在于提供含有上述新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的DNA的表達載體。

本發明的第五個目的在于提供一種耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的制備方法。

本發明的第六個目的在于提供一種解決市面上白藜蘆醇短缺的解決方法。

本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的：一種新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的DNA，命名為bgl2238，包含一個開放閱讀框，所述新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本發明提供的上述新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：