[發明專利]一種新型耐葡萄糖的β?葡萄糖苷酶基因及其應用

在審

• 申請號: 201710698739.8
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107828806A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 李荷;張雪玲;夏玉林
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12N15/66;C12P7/22
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司44259
• 代理人: 姚迎新

1.一種新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因命名為bgl2238，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示：

2.一種新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

3.一種如權利要求1所述的新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因的制備方法，其特征在于，步驟如下：

(1)建立黑龍江玉米土壤宏基因組庫，稱取黑龍江玉米土壤樣品提取總DNA；純化DNA；酶切總DNA；將回收得到的酶切片段和pUC118/EcoR I(BAP)載體連接，得到質粒pUC118-Bgl2238，將該質粒電擊轉化至大腸桿菌DH5α超級感受態建立黑龍江玉米土壤宏基因組文庫；

(2)從黑龍江玉米土壤宏基因組文庫中篩選一個具有黑色水解圈的陽性克隆子，測序，然后運用軟件對所得序列進行分析，并設計引物，從而克隆到目的片段。

4.一種包含新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因的重組質粒的制備方法，其特征在于，步驟是：根據新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因bgl2238的序列設計引物，權利要求1中新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因命名為bgl2238，以提取的質粒pUC118-Bgl2238為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物1，經限制性內切酶Xho I、EcoR I雙酶切并回收產物2，質粒pET32a經Xho I、EcoR I雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即重組質粒pET32a-Bgl2238；其中所述序列設計引物序列如下：

bgl2238-fw：5’-CCGGAATTCATGAAACACATCCTAAACCTATGCC-3’

(下劃線部分為EcoR I酶切位點)

bgl2238-rv：5’-CCGCTCGAGTTATCGTACGCTAAAAGTAAGGGCTTC-3’

(下劃線部分為Xho I酶切位點)。

5.一種含有如權利要求1所述的新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因的表達載體，其特征在于，采用如下方法構建新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因的表達載體：采用電轉法，將重組質粒pET32a-Bgl2238轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，將轉化后的細菌懸浮液恢復培養并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養板上培養，挑取陽性轉化子，獲得新型耐葡萄糖的β-葡萄糖苷酶基因的表達載體即大腸埃希氏菌BL21-pET32a-Bgl2238。

6.一種重組β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征是：步驟如下：重組質粒pET32a-Bgl2238轉化宿主細胞即大腸桿菌BL21感受態細胞；培養轉化體，從培養物中獲得重組β-葡萄糖苷酶。

7.根據權利要求6所述的一種重組β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，具體過程為：把重組質粒pET32a-Bgl2238轉化的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素抗性的平板上，37℃倒置培養過夜，挑取單克隆接種于LB液體培養基，37℃、180rpm振蕩培養過夜，按體積比1：100的比例轉接至新鮮的含氨芐青霉素抗性LB培養基，于37℃、180rpm培養至OD₆₀₀＝0.8，加入IPTG誘導培養，得到高效可溶性表達；培養后經Novagen公司的Ni-NTA Agerose鎳柱親和柱對重組β-葡萄糖苷酶進行純化，即得重組β-葡萄糖苷酶。

8.根據權利要求7所述的一種重組β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，步驟如下：IPTG終濃度為1.0～1.4mM，誘導溫度為25～37℃，誘導時間11h。