[發明專利]一種小麥外源基因插入位點的鑒定方法

在審

• 申請號: 201710698017.2
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107419021A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 丁博;謝曉東;郭雨;李明;曹雪松;李楊;詹瑤;邢欣欣;曹高燚;佟德清
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 劉奇

技術領域

本發明涉及轉基因作物鑒定技術領域，具體涉及一種小麥外源基因插入位點的鑒定方法。

背景技術

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，為全球人口提供了豐富的蛋白質和能量，也是我國第二大糧食作物。隨著人口的增加，未來全球對小麥的需求將呈大幅度增長的趨勢。因為基因的限制，小麥產量的增長是有限制的，不能通過傳統的栽培技術來滿足需求。轉基因技術可能成為緩解糧食安全問題的重要手段。為了滿足需求，需要通過基因工程的手段培育轉基因植物。轉基因技術是一種發展蓬勃的手段，能夠幫助培養出具有理想性狀的植株，具有巨大潛力。由于轉基因技術中目的基因插入的隨機性和插入位點基因表達的盲目性，轉基因作物的安全性引起了公眾的廣泛關注；且小麥等禾谷類作物基因轉化效率極低，而尋找一種有效的鑒別轉基因小麥的方法至關重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種小麥外源基因插入位點的鑒定方法。本發明提供的鑒定方法假陽性出現概率低，且能夠精確地定位外源基因的插入位置，本發明提供的方法對于后期轉基因植株功能的研究具有深遠的意義，為創育小麥新種質資源奠定了基礎。

本發明提供了一種小麥外源基因插入位點的鑒定方法，包括以下步驟：

1)以農桿菌介導法轉化后的小麥為材料提取小麥基因組；

2)依據Genome-walking的原理，基于步驟1)轉化用載體的T-DNA序列，設計3條嵌套的特異引物SP1、SP2和SP3；

3)以步驟2)得到的特異性引物SP1、SP2和SP3與染色體步移試劑盒結合進行熱不對稱交錯PCR反應，得到擴增片段；

4)將步驟3)得到的擴增片段與國際小麥基因組測序聯合會小麥基因組數據進行比對，得出外源基因在小麥中的插入位點。

優選的是，采用小麥葉片進行基因組的提取。

優選的是，所述染色體步移試劑盒為寶生物公司出售的染色體步移試劑盒；

所述染色體步移試劑盒包括以下組分：兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4、對照模板、TaKaRa LATaq、10×LAPCR Buffer II(Mg²⁺plus)、dNTP Mixture、6×Loading Buffer。

優選的是，所述步驟2)中3條特異性引物的Tm值獨立地為50～60℃。

優選的是，所述轉化用載體為pDTAAS。

優選的是，當轉化用載體為pDTAAS時，所述步驟2)設計得到的引物SP1的序列如SEQ ID NO.1所示，SP2的序列如SEQ ID NO.2所示，SP3的序列如SEQ ID NO.3所示。

優選的是，所述步驟4)中進行數據比對前還包括：將所述擴增片段中與轉化用載體互補的基因片斷去除。

本發明提供了一種小麥外源基因插入位點的鑒定方法。采用染色體步移技術，同時與生物信息學分析相結合，能夠在小麥基因組測序序列中精確地定位外源基因的插入位置，將插入位點精確到某個染色體的某個位點，篩選出外源基因插入小麥基因間或著絲粒區域的轉基因材料，可防止外源基因對小麥基因組的干擾，且本發明鑒定方法假陽性出現概率低，對于后期轉基因植株功能的研究具有深遠的意義，為創育小麥新種質資源奠定了基礎。

附圖說明

圖1為本發明中pDTAAS表達載體圖譜以及特異引物設計位置；

圖2為本發明實施例1提供的結合染色體步移試劑盒進行熱不對稱交錯PCR得到的擴增序列條帶；

圖3為本發明實施例1提供的樣品15外源基因插入位點鑒定結果圖；

圖4為本發明實施例1提供的樣品21外源基因插入位點鑒定結果圖；

圖5為本發明實施例1提供的樣品29外源基因插入位點鑒定結果圖。

具體實施方式

本發明提供了一種小麥外源基因插入位點的鑒定方法，包括以下步驟：

1)以農桿菌介導法轉化后的小麥為材料提取小麥基因組；

2)依據Genome-walking的原理，基于步驟1)轉化用載體的T-DNA序列，設計3條嵌套的特異引物SP1、SP2和SP3；

3)以步驟2)得到的特異性引物SP1、SP2和SP3與染色體步移試劑盒結合進行熱不對稱交錯PCR反應，得到擴增片段；

4)將步驟3)得到的擴增片段與國際小麥基因組測序聯合會小麥基因組數據進行比對，得出外源基因在小麥中的插入位點。