[發(fā)明專利]一種小麥外源基因插入位點(diǎn)的鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710698017.2
• 申請(qǐng)日: 2017-08-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107419021A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁博;謝曉東;郭雨;李明;曹雪松;李楊;詹瑤;邢欣欣;曹高燚;佟德清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津農(nóng)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所11569
• 代理人: 劉奇

1.一種小麥外源基因插入位點(diǎn)的鑒定方法，包括以下步驟：

1)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化后的小麥為材料提取小麥基因組；

2)依據(jù)Genome-walking的原理，基于步驟1)轉(zhuǎn)化用載體的T-DNA序列，設(shè)計(jì)3條嵌套的特異引物SP1、SP2和SP3；

3)以步驟2)得到的特異性引物SP1、SP2和SP3與染色體步移試劑盒結(jié)合進(jìn)行熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR反應(yīng)，得到擴(kuò)增片段；

4)將步驟3)得到的擴(kuò)增片段與國(guó)際小麥基因組測(cè)序聯(lián)合會(huì)小麥基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得出外源基因在小麥中的插入位點(diǎn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，采用小麥葉片進(jìn)行基因組的提取。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述染色體步移試劑盒為寶生物公司出售的染色體步移試劑盒；

所述染色體步移試劑盒包括以下組分：兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4、對(duì)照模板、TaKaRa LA Taq、10×LAPCR Buffer II(Mg²⁺plus)、dNTP Mixture、6×Loading Buffer。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟2)中3條特異性引物的Tm值獨(dú)立地為50～60℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化用載體為pDTAAS。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定方法，其特征在于，當(dāng)轉(zhuǎn)化用載體為pDTAAS時(shí)，所述步驟2)設(shè)計(jì)得到的引物SP1的序列如SEQ ID NO.1所示，SP2的序列如SEQ ID NO.2所示，SP3的序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述步驟4)中進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)前還包括：將所述擴(kuò)增片段中與轉(zhuǎn)化用載體互補(bǔ)的基因片斷去除。