[發明專利]一種用于檢測MTHFR和MTRR基因多態性的組合物及其應用

有效

• 申請號: 201710698006.4
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107385063B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 劉沛;王林海
• 申請（專利權）人: 北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 孫艷敏;楊敬

本發明公開了一種用于檢測MTHFR和MTRR基因多態性的組合物及其應用，通過FAM、HEX、ROX(修飾)三通道多重PCR反應對MTHFR和MTRR基因中的單核苷酸多態性位點進行檢測。為了提高檢測的簡便性和特異性，通過探針分型的技術手段實現一管分型檢測，使得整個操作以及反應過程簡單化，并在此基礎上，對探針進行鎖核酸修飾和二級結構修飾，增加探針的Tm值，進一步提高探針結合的特異性的，最后通過調整引物對的配比、Taq酶的用量、鎂離子的用量等，提高整個試劑盒的最低檢測限、準確性和特異性，試劑盒最低檢測濃度能夠達到1ng/μL，準確性和特異性均能夠達到100％。

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測MTHFR和MTRR基因多態性的技術。

背景技術

葉酸是一種水溶性B族維生素，因最初從菠菜葉中提取得到，故稱為葉酸。葉酸是合成核酸所必須的元素，是細胞生長和組織修復所必需的物質，更是胚胎發育過程中不可缺少的營養素。近年來大量研究已經證實，葉酸缺乏是導致出生缺陷的主要原因。葉酸的臨床功能除了預防胎兒神經管缺陷外，還能降低孕婦妊娠高血壓、自發性流產和胎兒宮內發育遲緩、早產以及新生兒低出生體重等發病率。

機體缺乏葉酸有兩個方面的原因：一是葉酸攝入量不足，二是由于遺傳(基因)突變導致機體對葉酸的利用能力低下。前者通過多食用富含葉酸食物，或適量補充葉酸制劑即可滿足機體需求；而攜帶相關基因突變的人群，即使按常量補充葉酸，也不能滿足機體代謝所需。葉酸代謝基因的差異，決定了葉酸利用能力的不同，因此，葉酸補充劑量應因人而異。

參與葉酸代謝最重要的兩個基因是亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)。研究發現，MTHFR的活性與C677T和A1298C基因位點有關；MTRR的活性與A66G基因位點有關。當基因位點發生突變時就會導致MTHFR和MTRR活性下降，進而引起葉酸利用能力不足，寶寶出生缺陷風險增加。

中國人群中存在一定比例的風險型基因----78％的國人存在葉酸利用能力相關基因突變，導致不同人對葉酸的利用能力不同，所以葉酸補充需要個性化。

因此，MTHFR和MTRR基因多態性檢測對于葉酸補充劑量有重要意義。而目前檢測MTHFR和MTRR基因多態性的核苷酸引物及方法準確性和特異性較低，難以在臨床廣泛應用。所以探索一種檢測MTHFR和MTRR基因多態性快速可靠的核苷酸引物組及方法已經成為臨床實驗研究的熱點問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測MTHFR和MTRR基因多態性的組合物及其應用，通過調整引物的配比、Taq酶的用量和鎂離子的用量等，通過FAM、HEX、ROX(修飾)三通道多重PCR反應，并且將引物放置到一管內分型檢測，提高檢測的簡便性和特異性，使得整個操作以及反應過程簡單化。并在此基礎上，對探針進行鎖核酸修飾和二級結構修飾，增加探針的Tm值，進一步提高探針結合的特異性的，最后通過上述體系的調整，使得準確性和特異性均能夠達到100％，最低檢測濃度能夠達到1ng/μL，解決了以往檢測MTHFR和MTRR基因多態性時準確性和特異性較低的問題。

為了實現上述目的，本發明提供的一種用于檢測MTHFR和MTRR基因多態性的組合物，包括分別針對用于檢測待檢樣品中與MTHFR和MTRR基因相關的特異性目的基因的引物對，包括：

MTHFR677引物：

MTHFR677基因正向引物(MTHFR677-F):AACAGGTGGAGGCCAGCCT(SEQ ID NO.1)；

MTHFR677基因反向引物(MTHFR677-R):GTGCGGTGAGAGTGGGGTG(SEQ ID NO.2)；

MTHFR677-CFP：FAM-TGAAAGCGGGAGCCGATTTCA-BHQ1(SEQ ID NO.3)；