[發明專利]非?FRET肉毒梭菌測定法

在審

• 申請號: 201710697371.3
• 申請日: 2012-05-31
• 公開（公告）號: CN107475293A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: D.阿塔帕圖;W.塔克
• 申請（專利權）人: 拜奧麥迪遜公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;G01N33/569;G01N33/58;C07K19/00;C12N5/10
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 羅文鋒

本申請為分案申請，原申請的申請日為2012年5月31日，申請號為201280036866.7(PCT/US2012/040240)，發明名稱為“非-FRET肉毒梭菌測定法”。

本申請要求2011年6月1日提交的美國臨時專利申請序列號61/492237的優先權權益。優先權申請，以及本文中所引用的所有其它出版物都通過引用結合到本文中，其程度如同特別并且逐一地指明每個出版物或專利申請以通過引用結合。如果所結合的參考文獻中的某術語的定義或用途與本文所提供的該術語的定義不一致或有沖突的話，以本文所提供的該術語的定義為準，而不采用參考文獻中的該術語的定義。

發明領域

本發明的領域是蛋白酶測定，具體而言是肉毒梭菌毒素相關的那些。

背景

肉毒梭菌神經毒素(BoNT)是由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產生的，是已知的最強毒素之一。這些毒素是公認的食物中毒的來源，常導致嚴重危害，甚至受害者死亡。有7種結構相關的肉毒梭菌神經毒素或血清型(BoNT/A-G)，每種都是由一條重鏈(約100 KD)和一條輕鏈(約50 KD)組成。重鏈通過受體-介導的胞吞作用而介導毒素進入靶細胞。一旦內在化之后，輕鏈從內體小泡腔易位到胞質溶膠，并起到鋅-依賴性蛋白酶的作用，以切割介導小泡-靶膜融合的蛋白質(“底物蛋白”)。

這些BoNT底物蛋白包括質膜蛋白突觸融合蛋白、外周膜蛋白SNAP-25和小泡膜蛋白小突觸泡蛋白(Syb)。這些蛋白質統稱為SNARE(可溶性N-乙基馬來酰亞胺-敏感因子連接蛋白受體)蛋白。SNARE蛋白的切割阻斷了小泡與質膜融合并廢止了在神經肌肉接頭的神經遞質的釋放。在SNARE蛋白中，突觸融合蛋白和SNAP-25通常駐留在靶膜上并因此而稱為t-SNARE，而小突觸泡蛋白則僅在突觸內的突觸小泡中被發現并稱為v-SNARE。這3種蛋白一起構成復合體，這被認為是介導小泡膜和質膜間融合的最小機器。在單一但不同的位點上，BoNT/A、E和C¹切割SNAP-25，BoNT/B、D、F、G切割小突觸泡蛋白(Syb)。除了SNAP-25之外，BoNT/C也切割突觸融合蛋白。

除非上下文有相反說明，否則本文中所給出的所有范圍都應理解為包括它們的端點在內，開放式的范圍應當理解為包括工業上實用的數值。同樣，數值的所有列表都應視為包括中間數值，除非上下文有相反說明。

因為BoNT作為食物中毒來源和作為生物恐怖武器的威脅，所以需要靈敏而快速地檢測它們。目前，檢測毒素的最靈敏方法是在小鼠中進行毒性測定。該方法需要大量小鼠，耗費時間，且不可用于研究毒素的催化動力學。也已開發出大量的擴增免疫測定系統(其基于使用針對毒素的抗體)，但大多數這類系統都需要復雜而昂貴的擴增過程，而且也不可用于研究毒素的催化活性。盡管HPLC和免疫測定可用于檢測切割的底物分子并測量這些毒素的酶活性，但這些方法通常耗時而復雜，它們中的某些需要專門的抗體，使得它們不適用于大規模篩選。因此，需要用于檢測BoNT的新的和改進的方法和組合物。

在過去幾年中，研究人員已經開始研究FRET測定法在檢測BoNT中的用途。在FRET測定中，2個熒光生成的(fluorigenic)氨基酸衍生物用于置換含有毒素切割位點的合成短肽(12-35個氨基酸)中的2個天然氨基酸。一個氨基酸衍生物的熒光信號被另一個氨基酸衍生物猝滅，當它們在肽中彼此靠近時。該機制稱為“熒光共振能量轉移(F?rster resonance energy transfer，FRET)”。肽的切割將這兩個氨基酸衍生物分開，使得可以檢測在FRET中的降低。

FRET測定法已經成功用于檢測BoNT。(參見例如美國專利申請號2004/0191887(授予Chapman)，2003年10月28日申請，美國專利申請號2006/0134722(授予Chapman)，2004年12月20日申請，美國專利號7208285(授予Steward)(2007年4月)，美國專利號7183066(授予Fernandez-Salas)(2007年2月)和申請US2011/0033866 (2010年2月公布)。

盡管在應用FRET測定法以檢測BoNT中已經證明了某些成功，但是對于許多目的而言，靈敏性和特異性仍不合乎需要。