[發明專利]應用二代測序技術分析牙髓干細胞與根尖牙乳頭干細胞差異miRNAs表達譜的方法

在審

• 申請號: 201710696934.7
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107267655A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 呂紅兵;林詩晗;胡雪剛;邱在玲
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學附屬口腔醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 福州市鼓樓區京華專利事務所(普通合伙)35212
• 代理人: 林曉琴

技術領域

本發明涉及一種分析牙髓干細胞與根尖牙乳頭干細胞差異miRNAs表達譜的方法，具體涉及一種應用二代測序技術分析兩種干細胞中差異 miRNAs表達譜的方法。

背景技術

牙齒借助牙根與牙槽骨緊密結合，牙根的穩固在牙列的穩定中非常重要。臨床中常見的例如牙周炎、牙隱裂、牙外傷等疾病都會導致牙根的缺失、折斷、發育異常等，最終都會造成牙的缺失。牙缺失后，生物學牙根的研究具有重要的意義。

目前，生物學牙根的研究在體外主要是通過組織工程學的方法來構建。其中通過不同的牙源性干細胞組合在支架材料中構建牙齒是目前常用的方法之一。生物學牙根在臨床上也有實際的應用，目前最常用的方法是牙髓血運重建術。牙髓血運重建術用來治療根尖未發育完成的年輕恒牙牙髓壞死和根尖周炎，它不僅可以繼續延續牙根的發育，而且增加了根部牙本質的厚度，避免了根尖誘導成形術和根尖屏障術后由于根管壁薄弱所造成的折裂風險。這些都表明，根尖部保留有健康的干細胞對于牙髓再生、牙體組織再生和牙根的繼續發育發揮了重要的作用。

人牙源性間充質干細胞，包括牙髓干細胞、根尖牙乳頭干細胞和牙囊干細胞等。其中，牙髓干細胞(denal pulp stem cells,DPSCs)和根尖牙乳頭干細胞(Stem cell from the apical papilla,SCAP)與牙髓、牙根形成密切相關。

多年來，牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞一直都是眾多學者研究的熱點。在組織工程中，牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞都是理想的細胞來源，根尖牙乳頭干細胞來源于生長發育期的根尖孔未閉合的年輕恒牙，可能是更早期、更優越的牙源性干細胞資源，用于牙髓、牙本質的再生和生物學牙根的再生中具有優勢，是組織構建的首選，更是成為近年來牙髓血運重建治療研究領域中的焦點之一。

牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞的干性能力，是牙髓組織工程中最重要的，其干性維持及分化能力涉及多個蛋白編碼基因及多條信號通路。如果單純地控制一個分子乃至一條通路，將無法高效地維持干細胞干性和調控分化進程。其中，關于牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞的生物學作用，來源以及分離方法等方面的研究，都取得了不小的進展，這將為重新認識干細胞生物學特性提供新的參考依據。

隨著近年來miRNAs數量的爆炸式增長，據悉在2004年中，miRNAs 的數量總就有719個，到了2010年9月，miRBase數據庫內的miRNAs序列信息更是已經超過一萬五千條。故此，本發明應用二代測序技術分析干細胞的miRNAs表達譜，對于檢測牙髓干細胞與根尖牙乳頭干細胞中差異 miRNAs表達譜的變化，具有深遠的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種應用二代測序技術分析牙髓干細胞與根尖牙乳頭干細胞差異miRNAs表達譜的方法。

本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：

一種應用二代測序技術分析牙髓干細胞與根尖牙乳頭干細胞差異 miRNAs表達譜的方法，其特征在于：包括如下操作步驟：

(1)培養牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞：選取新鮮拔除的第三磨牙，在無菌條件下取出牙髓、根尖牙乳頭組織，將組織剪碎，并采用I型膠原酶及dispase 酶于37℃下消化30min，之后離心重懸，用細胞篩過濾重懸液，獲得單細胞懸液；

(2)牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞的分選：對步驟(1)中獲得的單細胞懸液，利用胰酶消化收集其中對數生長期的細胞，并依據抗體說明書采用鼠抗人STRO-1-PE標記細胞，經免疫磁珠分選收集STRO-1陽性細胞，所收集到的STRO-1陽性細胞即為所需的牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞；

(3)二代測序技術檢測細胞miRNAs表達譜：分別取步驟(2)經分選后的牙髓干細胞和根尖牙乳頭干細胞，加入Trizol混合后抽提總RNA；使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit，按照廠家的標準流程，主要步驟如下：測定RNA 的濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性、以及測定RNA的RIN值，完成 RNA樣本質檢后，使用接頭對切膠回收的20-40nt的miRNAs的3’與5’端進行連接，逆轉錄合成cDNA第一鏈，隨后進行PCR擴增，PCR擴增產物經PAGE 電泳質檢、切膠純化、濃度測定以及質檢后，將濃度統一調整為2nM，miRNAs 文庫構建即告完成；待測miRNAs文庫在cBot上完成簇類生長，然后將流通池轉移到基因測序系統上，按照標準流程進行二代測序及數據分析。

所述接頭序列如下：