[發(fā)明專利]應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)分析牙髓干細(xì)胞與根尖牙乳頭干細(xì)胞差異miRNAs表達(dá)譜的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710696934.7
• 申請(qǐng)日: 2017-08-15
• 公開（公告）號(hào): CN107267655A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂紅兵;林詩(shī)晗;胡雪剛;邱在玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 福州市鼓樓區(qū)京華專利事務(wù)所(普通合伙)35212
• 代理人: 林曉琴

1.一種應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)分析牙髓干細(xì)胞與根尖牙乳頭干細(xì)胞差異miRNAs表達(dá)譜的方法，其特征在于：包括如下操作步驟：

(1)培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞和根尖牙乳頭干細(xì)胞：選取新鮮拔除的第三磨牙，在無菌條件下取出牙髓、根尖牙乳頭組織，將組織剪碎，并采用I型膠原酶及dispase酶于37℃下消化30min，之后離心重懸，用細(xì)胞篩過濾重懸液，獲得單細(xì)胞懸液；

(2)牙髓干細(xì)胞和根尖牙乳頭干細(xì)胞的分選：對(duì)步驟(1)中獲得的單細(xì)胞懸液，利用胰酶消化收集其中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，并依據(jù)抗體說明書采用鼠抗人STRO-1-PE標(biāo)記細(xì)胞，經(jīng)免疫磁珠分選收集STRO-1陽(yáng)性細(xì)胞，所收集到的STRO-1陽(yáng)性細(xì)胞即為所需的牙髓干細(xì)胞和根尖牙乳頭干細(xì)胞；

(3)二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜：分別取步驟(2)經(jīng)分選后的牙髓干細(xì)胞和根尖牙乳頭干細(xì)胞，加入Trizol混合后抽提總RNA；使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit，按照廠家的標(biāo)準(zhǔn)流程，主要步驟如下：測(cè)定RNA的濃度、瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性、以及測(cè)定RNA的RIN值，完成RNA樣本質(zhì)檢后，使用接頭對(duì)切膠回收的20-40nt的miRNAs的3’與5’端進(jìn)行連接，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PAGE電泳質(zhì)檢、切膠純化、濃度測(cè)定以及質(zhì)檢后，將濃度統(tǒng)一調(diào)整為2nM，miRNAs文庫(kù)構(gòu)建即告完成；待測(cè)miRNAs文庫(kù)在cBot上完成簇類生長(zhǎng)，然后將流通池轉(zhuǎn)移到基因測(cè)序系統(tǒng)上，按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行二代測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。