[發明專利]一組干酪乳桿菌基因敲除載體及其應用

有效

• 申請號: 201710696363.7
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107502619B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 孔健;郭婷婷;辛永平
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12R1/245
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一組干酪乳桿菌基因敲除載體，包括一個介導外源雙鏈DNA敲除盒up?lox66?cat?lox71?down與染色體上同源序列之間的同源重組的專用載體pMSP456和一個介導lox66和lox71位點之間的重組反應以便切除抗性基因的專用載體pMSPcre；其中載體pMSP456的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，載體pMSPcre的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發明還公開了所述載體在構建干酪乳桿菌基因敲除突變株中的應用。實驗證實利用本發明的載體pMSP456和pMSPcre敲除干酪乳桿菌基因，其敲除效率達到100％，且操作簡單，耗時短，在干酪乳桿菌代謝工程中具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，涉及一組基因敲除專用載體，尤其涉及介導外源雙鏈DNA敲除盒(up-lox66-cat-lox71-down)與染色體上同源序列之間的同源重組的專用載體以及介導lox66和lox71位點之間的重組反應以便切除抗性基因的專用載體，及其在高效快速地構建干酪乳桿菌基因敲除突變株中的應用。

背景技術

干酪乳桿菌是一種革蘭氏陽性菌，廣泛應用于乳品加工。目前發現干酪乳桿菌對宿主具有顯著的益生作用，如調節炎癥、促進免疫、改善胃腸道功能障礙、防止過敏等，故常作為益生菌應用于保健品和健康飲品的研制和生產。但是，進一步研究該菌株的生理功能和作用機制以及對干酪乳桿菌遺傳改造時，缺乏高效的遺傳操作工具。

目前干酪乳桿菌基因敲除和定點插入載體主要包括兩種：條件型整合載體及帶有反向篩選標記的整合載體，其原理均是利用宿主自身重組酶RecA介導的同源雙交換。由于本底水平表達的重組酶RecA活力較低，導致同源重組效率低，操作步驟繁瑣，成為限制干酪乳桿菌遺傳改造的限制因素。隨著基因組測序技術迅速發展，新的重組酶功能基因組被發現和應用，對干酪乳桿菌新型載體的構建提供了可能。但經檢索，有關介導外源雙鏈DNA敲除盒(up-lox66-cat-lox71-down)與染色體上同源序列之間的同源重組的專用載體pMSP456以及介導lox66和lox71位點之間的重組反應以便切除抗性基因的專用載體pMSPcre及其應用的專利未見報道。

發明內容

針對現有基因敲除載體的不足，本發明提供了一組干酪乳桿菌基因敲除載體及其應用。

本發明所述的一組干酪乳桿菌基因敲除載體，包括一個介導外源雙鏈DNA敲除盒up-lox66-cat-lox71-down與染色體上同源序列之間的同源重組的專用載體，命名為pMSP456和一個介導lox66和lox71位點之間的重組反應以便切除抗性基因的專用載體，命名為pMSPcre；

其中：

所述載體pMSP456由重組酶LCABL_13040，LCABL_13050、LCABL_13060即LCABL_13040-50-60，復制起始蛋白RepD、RepE、RepG，紅霉素抗性篩選標記以及NICE誘導表達系統元件NisR、NisK及nisA啟動子PnisA構成；其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述載體pMSPcre由Cre重組酶，復制起始蛋白RepD、RepE、RepG，紅霉素抗性篩選標記以及NICE誘導表達系統元件NisR、NisK及nisA啟動子PnisA構成；其核苷酸序列如SEQID No.2所示。

上述兩個干酪乳桿菌基因敲除專用載體構建方法及步驟是：

(1)擴增引物設計(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，PAGE純化)。

擴增LCABL_13040-50-60所用引物：

456F：5’-AACTGCAGATGACCATGCTTGATTACAACACAG-3’