[發(fā)明專利]基于原子力顯微鏡的啟動子體外強度表征的新方法

在審

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• 申請日: 2017-08-14
• 公開（公告）號: CN107368709A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉娟;許正宏;張曉梅;史勁松;姚智絢
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: G06F19/24
• 分類號: G06F19/24
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)的啟動子體外強度表征的方法。

背景技術(shù)

在基因表達過程中，啟動子是一個重要的順式調(diào)控元件(cis-acting element)。通過改變啟動子強度，調(diào)控關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，精細調(diào)節(jié)代謝流量的分配，從而實現(xiàn)在追求產(chǎn)物最大積累效率的同時減少細胞代謝負擔(dān)，成為工業(yè)微生物領(lǐng)域的研發(fā)熱點。近年來，隨著代謝工程及合成生物學(xué)的發(fā)展，以啟動子為代表的代謝調(diào)控元件的標準化、模塊化處理是一大趨勢，因此需要高效、精確定量表征啟動子活性的策略。

目前通過報告基因的表達量來評價啟動子活性是比較常用的策略。然而這種分析方法操作繁瑣、周期長、易受到菌體生長階段和生理狀態(tài)的干擾，最終的表達量還受到其他多重元件的調(diào)控，并不能直接體現(xiàn)啟動子的調(diào)控效果，并且造成不同表達系統(tǒng)之間啟動子強度數(shù)據(jù)無法直接比較的問題。加之受到檢測方法的限制，導(dǎo)致定量分析效率低，準確度不高，制約了啟動子元件化，標準化的發(fā)展。此外，EMSA、體外轉(zhuǎn)錄等方法也為我們提供了體外表征啟動子活性的選擇，但由于其準確度低，操作復(fù)雜，需要標記等缺點，并未受到廣泛使用。

啟動子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要順式元件，RNAp通過其σ亞基識別并結(jié)合在啟動子核心區(qū)域的-10以及-35區(qū)的保守序列，從而啟動轉(zhuǎn)錄。啟動子與RNAp特異性結(jié)合是啟動轉(zhuǎn)錄的第一步，也是最關(guān)鍵的一步，它們的結(jié)合強度決定了轉(zhuǎn)錄水平的高低。從分子交互作用的角度考察啟動子與RNAp的識別機制，可以為啟動子強度的精準量化表征提供新的策略。因此，開發(fā)基于分子交互作用的啟動子精確定量表征方法具有重大意義，同時可行性較強。利用AFM力譜分析，以原核生物啟動子為例，并人工設(shè)計關(guān)鍵位點突變的一系列啟動子，在體外從多角度分析啟動子與RNAp間的交互作用，采集包括結(jié)合概率，交互作用力等量化參數(shù)。得到的交互作用參數(shù)與利用體內(nèi)報告基因(cat)表達量表征得到的啟動子強度進行關(guān)聯(lián)、驗證，進而構(gòu)建基于體外交互作用分析的啟動子強度初步篩選方法，為可精準調(diào)控啟動子元件研究提供新策略。而現(xiàn)有技術(shù)中沒有通過采用原子力顯微鏡直接測量啟動子與RNA聚合酶之間的相互作用力，實現(xiàn)體外基于AFM力譜分析啟動子強度的研究目前仍相對缺乏。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)力譜的啟動子體外強度表征的方法。通過采集得到1000多條啟動子-RNA聚合酶力-距離曲線，對這些曲線進行統(tǒng)計得到交互作用力值及結(jié)合概率。利用R語言結(jié)合力、結(jié)合概率的參數(shù)與傳統(tǒng)的啟動子強度表征策略-通過報告基因表達量進行相關(guān)性分析，證明了該方法的可行性，并具有檢測時間短、效率高、步驟少等優(yōu)點。實現(xiàn)了體外基于AFM力譜分析啟動子強度的新方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

首先在液體環(huán)境中采集得到1000多條啟動子-RNA聚合酶力-距離曲線，設(shè)定10-40nm的解離距離內(nèi)出現(xiàn)的交互作用力為待采集的特異性交互作用力。接著對這些曲線進行統(tǒng)計得到特異性作用力分布圖，分析得到交互作用力值及結(jié)合概率。最后通過R語言對所有體外參數(shù)與報告基因(cat)表達量進行相關(guān)性分析，證明了該方法的可行性。包括以下步驟：

1.啟動子-RNA聚合酶力-距離曲線采集的具體方法是：在液體環(huán)境中采用AFM的接觸模式測定了T7啟動子與T7RNAp間的交互作用力，并且選擇SP6啟動子為對照。

2.待采集的特異性交互作用力的具體方法是：設(shè)定10-40nm的解離距離內(nèi)出現(xiàn)的交互作用力為待采集的特異性交互作用力。即在力-距離曲線中，小于10nm距離內(nèi)出現(xiàn)的交互作用為非特異性事件，不收集數(shù)據(jù)；而出現(xiàn)在10-40nm之間的交互作用事件會被記錄下參數(shù)，進行后續(xù)的統(tǒng)計分析。

3.獲得特異性交互作用力的具體方法是：通過對上述的這些曲線進行統(tǒng)計得到特異性作用力分布圖，T7啟動子與T7RNAp間的交互作用力大小主要集中在100-500pN的范圍內(nèi)，概率分布圖滿足高斯分布，通過統(tǒng)計分析得到啟動子與聚合酶的作用力的大小(結(jié)合力分布峰值)即為交互作用力值。

4.獲得結(jié)合概率的具體方法是：存在典型交互作用事件的曲線的數(shù)量占樣本總量的比例即為結(jié)合概率。