[發明專利]一種卵母細胞激活的物理方法及其受精潛能的評價指標

有效

• 申請號: 201710692030.7
• 申請日: 2017-08-14
• 公開（公告）號: CN107312749B
• 公開（公告）日: 2020-11-10
• 發明（設計）人: 鹿群;劉佳卉;梁蓉;國晉菘;王建六;王凱樂;董飛宏;張玨;方競
• 申請（專利權）人: 北京大學人民醫院;北京大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12N13/00;G01N21/64;G01N21/63
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 蘇愛華

本發明涉及一種卵母細胞激活的物理方法及其受精潛能的評價指標，采用電脈沖序列激活卵母細胞，用共聚焦顯微鏡下檢測到的胞漿內鈣離子濃度變化所形成的鈣振蕩特征作為卵母細胞受精潛能的評價指標。

技術領域：

本發明涉及胚胎工程領域，特別涉及輔助生殖領域中一種卵母細胞激活的物理方法，以及一種評價精子或人工輔助方法激活卵母細胞時其受精潛能的評價指標。

技術背景

如今，全球約有10％-16％的夫婦面臨著不孕不育的問題。盡管輔助生殖技術的誕生已經幫助了許多不孕不育的患者，但是受精失敗的現象依然普遍存在。在輔助生殖領域中，卵母細胞單精子顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的應用最為廣泛，它借助顯微鏡操作系統，人工地將單一的精子注射到卵母細胞內使其受精，可以使受精率明顯提高到70％。但是任然有相當一部分患者在進行ICSI后無法受精，研究發現由于精子自身存在缺陷而導致的卵母細胞激活不足是ICSI受精失敗的主要原因。

所謂的卵母細胞激活，就是指在成熟促進因子(M-Phase promoting factor,MPF)保持穩定的作用下，哺乳動物成熟的卵母細胞會發育并停留在減數第二次分裂中期，既MII期，只有在精子或人工方式的刺激下，卵母細胞才能恢復并完成減數分裂，這個過程被稱為卵母細胞的激活。

精子刺激卵母細胞后，會引起卵母細胞發生一系列形態上和生理上的反應，主要包括細胞內鈣濃度短暫性的升高以及隨后發生的鈣振蕩、第二極體釋放、形成雌、雄雙原核等等。其中，細胞內鈣離子濃度的升高和鈣振蕩的形成，不僅被認為是誘導激活后一系列反應的必要因素，更是接下來胚胎發育的重要環節。并且鈣振蕩的頻率、振幅、持續時間等，都會影響著細胞周期的進程以及早期胚胎發育過程中蛋白質的表達

為了解決ICSI受精失敗的問題，現在通常會采用人工激活的方式來幫助精子刺激卵母細胞，從而誘導卵母細胞內Ca2+濃度脈沖式的升高或者Ca2+振蕩來實現激活。其中，卵母細胞激活率、囊胚率和能否誘導鈣離子振蕩是人們主要關注的問題。目前人工激活卵母細胞的方法主要有：化學激活法、電學激活法、機械激活法，在化學法中最常用的激活試劑包括乙醇、鈣離子載體A23187、離子霉素、鍶離子等等。

這些方法能在一定程度上提高卵母細胞的激活效率，但其中化學法和機械法的操作復雜、重復性差、且激活效率和胚胎發育潛能還有待提高。而傳統的電學激活方法能量過大，容易對細胞產生損傷。

發明內容

本發明的目的是提供一種操作簡便、高效可控的卵母細胞激活方法，可提高卵母細胞的激活效率和胚胎發育潛能，以及提供一種評價精子或人工方式刺激卵母細胞后其受精潛能的評價指標，為輔助生殖中胚胎移植提供理論依據。

為實現以上技術效果，本發明采用以下的技術方案：

本發明是基于納秒級脈寬的脈沖電場能誘導卵母細胞出現鈣離子振蕩的現象，用胞漿內鈣離子濃度變化所形成的鈣振蕩的特征作為卵母細胞受精潛能的評價指標。

上述的卵母細胞激活方法，首先將卵母細胞及卵母細胞培養液HTF置于電極杯后施加電脈沖序列進行處理，將處理后的卵母細胞經培養液洗滌2-4次，移入36-37℃、5-10％CO₂的培養箱中連續培養7-8天。

優選地，先用電場強度為35kV/cm-50kV/cm，脈沖頻率為0.5Hz-1.5Hz，脈沖寬度為30ns-300ns的脈沖作用3-10秒，緊接著用電場強度為5kV/cm-35kV/cm，脈沖頻率為0.5Hz-1.5Hz，脈沖寬度為10ns-30ns的脈沖作用3-5秒。

上述的卵母細胞受精潛能的評價指標，其特征在于：用卵母細胞胞漿內鈣離子濃度變化所形成鈣振蕩的特征作為評價卵母細胞受精潛能的指標。