[發(fā)明專利]一種直接體外誘導(dǎo)人外周血單個核細胞成為復(fù)合型抗原非特異性調(diào)節(jié)性T細胞的方法

有效

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• 申請日: 2017-08-14
• 公開（公告）號: CN107603948B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳剛;王璐
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢圣濟科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務(wù)所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發(fā)明提供了一種直接體外誘導(dǎo)人外周血單個核細胞成為復(fù)合型抗原非特異性調(diào)節(jié)性T細胞的方法，直接利用分離方法簡單、來源豐富的人外周血單個核細胞(即PBMCs)，經(jīng)過能符合臨床藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)的簡便誘導(dǎo)方法，在短期內(nèi)將PBMCs誘導(dǎo)并擴增成為包含CD4⁺CD25⁺CD127^dim和CD8⁺CD25⁺CD127^dim兩種調(diào)節(jié)性T細胞在內(nèi)的復(fù)合型Treg。這種復(fù)合型Treg純度高、兼具兩種Treg的調(diào)節(jié)功能、具有抗原非特異性，有廣泛應(yīng)用于致病抗原不明確、難治性T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病治療的前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種直接體外誘導(dǎo)人外周血單個核細胞成為復(fù)合型抗原非特異性調(diào)節(jié)性T細胞的方法。

背景技術(shù)

在很多自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，T細胞針對自身抗原的異常激活發(fā)揮關(guān)鍵的作用。調(diào)節(jié)性T細胞對異常免疫應(yīng)答具有強大的免疫調(diào)節(jié)作用，如能體外擴增足夠數(shù)量的自體抗原非特異性調(diào)節(jié)性T細胞進行體內(nèi)回輸，將很可能抑制體內(nèi)發(fā)生的異常免疫應(yīng)答，從而使自身免疫性疾病得到控制。此外，自體調(diào)節(jié)性T細胞回輸體內(nèi)后不會發(fā)生針對異己的免疫性破壞，因而可能存活和發(fā)揮較長時間的作用。在器官移植的情況下，器官捐獻者(供者)與接受移植者(受者)是遺傳背景不同的個體，因此，不可避免會發(fā)生急、慢性免疫排斥反應(yīng)，而這正是影響移植治療效果最主要的原因。介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)的主體是受者體內(nèi)的效應(yīng)性淋巴細胞，它們識別外來移植物抗原后活化、增殖并分泌大量效應(yīng)分子，直接和/或間接地導(dǎo)致移植物損傷，目前，需要終身使用免疫抑制劑來控制效應(yīng)細胞的功能，但是，長期服用免疫抑制劑會帶來感染、惡性腫瘤、心血管疾病、肝腎毒性等毒副作用，而且還無法阻止慢性排斥所導(dǎo)致的移植物功能喪失。因此，人們正努力尋找新的控制排斥反應(yīng)的方法，以替代這些化學(xué)藥物。大量實驗研究表明，人體內(nèi)存在一類具有免疫負性調(diào)節(jié)功能的細胞，能有效抑制效應(yīng)細胞的功能，其中最重要的是調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)。獲得足夠數(shù)量Treg的方法主要分兩類，一類是分離出天然存在于機體內(nèi)的Treg，然后在體外擴增，由于天然Treg的數(shù)量極少，需要進行多個周期的增殖培養(yǎng)(每6～7天為一個周期)，然而在此過程中，Treg的調(diào)節(jié)能力容易丟失；另一類方法是分離出機體內(nèi)大量存在的靜息T細胞(naive T細胞)，然后在體外利用抗原呈遞細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)出Treg，其具有抗原特異性，只能抑制能與供者抗原起作用的效應(yīng)細胞，從而避免廣泛的免疫抑制，盡管該類方法有眾多的誘導(dǎo)方案，但幾乎都受到誘導(dǎo)條件的限制(如抗原呈遞細胞不易獲取、價格昂貴、操作復(fù)雜、不符合臨床標準等)而僅適合于實驗研究，不利于臨床開展。

發(fā)明內(nèi)容

基于調(diào)節(jié)性T細胞(即Treg)具有良好的抑制免疫應(yīng)答作用，體外誘導(dǎo)擴增的Treg可能應(yīng)用于治療T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病或應(yīng)用到器官移植領(lǐng)域誘導(dǎo)同種抗原免疫耐受。與抗原特異性Treg相比，抗原非特異性Treg應(yīng)用適應(yīng)癥可能更為廣泛，但目前現(xiàn)有技術(shù)存在的最大問題是體外誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞成本昂貴、耗時長、誘導(dǎo)效率較低、表型及調(diào)節(jié)作用不穩(wěn)定等。本發(fā)明利用物極必反原理，采用文獻從未報道過的全新方法，直接利用分離方法簡單、來源豐富的人外周血單個核細胞(即PBMCs)，經(jīng)過能符合臨床藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)的簡便誘導(dǎo)方法，在短期內(nèi)PBMCs誘導(dǎo)并擴增成為包含CD4⁺CD25⁺CD127^dim和CD8⁺CD25⁺CD127^dim兩種調(diào)節(jié)性T細胞在內(nèi)的復(fù)合型Treg。這種復(fù)合型Treg純度高、兼具兩種Treg的調(diào)節(jié)功能、具有抗原非特異性，因此有可能廣泛應(yīng)用于致病抗原不明確、難治性T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的治療。

本發(fā)明提供了一種直接體外誘導(dǎo)人外周血單個核細胞成為復(fù)合型抗原非特異性調(diào)節(jié)性T細胞的方法，步驟包括：

S1、從人外周血中分離出外周血單個核細胞PBMCs；