[發明專利]一種直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法

有效

• 申請號: 201710691462.6
• 申請日: 2017-08-14
• 公開（公告）號: CN107603948B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 陳剛;王璐
• 申請（專利權）人: 武漢圣濟科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

1.一種直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法，其特征在于：步驟包括：

S1、從人外周血中分離出外周血單個核細胞PBMCs；

S2、將PBMCs重懸于含5～10％AB型人血清或自體血清的AIM-V CTS培養基，計數細胞總量，加入1:1數量的抗CD3/CD28磁珠和終濃度為500～1000U/ml的rhIL-2，刺激培養6～7天誘導結束，培養過程中每3天補加一次rhIL-2；

S3、磁場去除抗CD3/CD28的磁珠，計數誘導后所獲得的活細胞數量，取少量細胞進行T細胞進行表型和純度的鑒定；

S4、將剩余誘導后的T細胞重懸于含5～10％人血清的AIM-V CTS培養基，加入終濃度為100～200U/ml的rhIL-2，培養22～26h以靜息誘導后的T細胞，分選活細胞；

S5、取部分步驟S4獲得的活細胞進行混合淋巴細胞培養，其余細胞用生理鹽水重懸。

2.如權利要求1所述的直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法，其特征在于：步驟S5所述混合淋巴細胞培養為：以步驟S1所述PBMCs為反應細胞，直接將抗CD3/CD28抗體作為刺激源提供T細胞激活的第一及第二信號，進行混合淋巴細胞培養，在混合淋巴細胞培養體系中加入步驟S4所述分選的活細胞共同培養3～6天，通過流式細胞術檢測反應細胞的增殖水平。

3.如權利要求2所述的直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法，其特征在于：所述反應細胞與分選的活細胞添加量之比為1:1～1:0.125。

4.如權利要求1所述的直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法，其特征在于：步驟S1所述分離出外周血單個核細胞PBMCs的方法為Ficoll分離法或采用血細胞分離機及配套管路采集PBMCs。

5.權利要求4所述的直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法，其特征在于：所述Ficoll分離法的步驟包括：向人外周血中加入等體積生理鹽水稀釋并混勻后，利用人Ficoll淋巴細胞分離液，通過密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞。

6.如權利要求1所述的直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法，其特征在于：步驟S3所述表型和純度的鑒定包括通過流式細胞術檢測CD3、CD19、CD4、CD8、CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4、CD62L、CXCR3分子的表達。

7.如權利要求1所述的直接體外誘導人外周血單個核細胞成為復合型抗原非特異性調節性T細胞的方法，其特征在于：步驟S5所述生理鹽水含2％人血清白蛋白。