[發明專利]一種測定赭曲霉毒素A的超靈敏比色傳感檢測方法

在審

• 申請號: 201710689444.4
• 申請日: 2017-08-14
• 公開（公告）號: CN107723347A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 樊之雄
• 申請（專利權）人: 樊之雄
• 主分類號: C12Q1/6862
• 分類號: C12Q1/6862
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種測定赭曲霉毒素A的超靈敏比色傳感檢測方法，屬于生物檢測領域。

背景技術

赭曲霉毒素是真菌產生的一組結構類似物，主要有A、B、C、D四種化合物，其中毒性最大、與人類健康關系最密切、產毒量最高、對農作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉毒素A。赭曲霉毒素A是由曲霉屬和青霉屬產生的有毒代謝產物，主要由純綠青霉、赭曲霉和碳黑曲霉產生，廣泛分布于自然界，在谷物及其制品、動物飼料、動物制品、可可和巧克力等產品中污染率較高，具有強烈的腎臟毒性和肝臟毒性，并有致畸、致突變和致癌作用，因此對人類健康構成和畜牧業發展巨大的潛在威脅，因此開發超靈敏的赭曲霉毒素A檢測方法尤為重要。

目前檢測赭曲霉毒素A的儀器方法有液相色譜、氣相色譜、質譜和毛細管電泳法等，雖然這些方法靈敏度較高，結果穩定，但所需儀器設備昂貴，樣品準備耗時長，不適于大量樣品的篩選，限制了此類方法的大規模應用。基于抗原抗體反應的免疫學方法沒有昂貴儀器的限制，但是高靈敏度高選擇性的抗體制備需要較長的周期，同時抗體的穩定性也極易受到所處環境的限制，因此對檢測效果的穩定性具有很大的影響。適配體是通過指數富集的配體系統進化技術（SELEX）篩選的一類能夠識別目標分子的一段單鏈DNA或RNA分子，這類分子對目標分子的識別具有高親和性，并且具有穩定性好、易于制備、重復使用、易于修飾等優點，因此適配體作為識別分子被廣泛應用于生物檢測中。

金納米粒子具有獨特的光學特性，包括：表面等離子共振、較高的吸收和消光系數以及依賴于粒徑和距離的一些性質，使得金納米粒子作為生物探針已廣泛應用于基礎和應用研究，尤其是根據金納米粒子聚集程度的變化而顯現出的顏色變化，可以開發通過肉眼可以識別的比色傳感器，使得生物分子的檢測更加便捷。連接酶鏈式反應是在熱穩定的DNA連接酶的作用下，可以實現較短雙鏈DNA分子切口的連接，因此在模板存在的條件下可以將金納米粒子修飾的兩段DNA探針分子與模板互補雜交，形成的切口通過連接酶進行連接形成一條完整的DNA鏈，再以新形成的金納米粒子單鏈DNA分子為新的模板，通過加入探針分子再次形成起始模板分子，從而實現模板鏈和金納米粒子單鏈DNA分子的擴增，起始模板含量越多，擴增出的的金納米粒子單鏈DNA分子越多，金納米粒子顏色越深。

本發明借助于赭曲霉毒素A適配體特異性識別赭曲霉毒素A分子，從而使得與適配體部分堿基互補的DNA分子解離下來，以解離下的DNA分子為模板，并以與模板互補的金納米粒子修飾的兩種DNA分子和與模板序列相同的兩種DNA分子為探針，通過連接酶鏈式反應進行擴增，在不同濃度赭曲霉毒素A的條件下，隨著赭曲霉毒素A濃度的增加，解離下的用于連接酶鏈式反應的模板DNA分子越多，則DNA探針修飾的金納米粒子的組裝程度越大，金納米粒子顏色越深，根據赭曲霉毒素A的濃度與紫外吸收比值A630/A521的對應關系，從而對赭曲霉毒素A的含量進行檢測。

發明內容

要解決的技術問題：由于傳統儀器檢測方法設備昂貴，樣品準備耗時長，不適于大量樣品的篩選，限制此類方法的大規模應用；基于抗原抗體的免疫學方法依賴抗體的靈敏度和特異性，因此抗體的質量限制了免疫學方法的靈敏度和準確性。

技術方案：本發明公開了一種測定赭曲霉毒素A的超靈敏比色傳感檢測方法，包括如下具體步驟：

（1）磁納米粒子修飾赭曲霉毒素A適配體

將新合成的粒徑為200-400nm濃度為1mg mL^-1的羧基修飾的磁納米粒子，用pH7.4的0.01M的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，再向1mL稀釋好的磁納米粒子中加入0.068 mg 碳二亞胺和0.15mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺，將其放到搖床上在室溫條件下振蕩活化20min，然后將50μL濃度為10μM的3’端氨基修飾的赭曲霉毒素A適配體DNA片段加入以上活化好的磁納米粒子中，室溫條件下振蕩反應3h后，用磁力架吸附磁納米粒子使其在離心管底部聚集，同時去除上清液以除去未偶聯的游離適配體DNA分子，然后加入1mL 0.01M的pH8.0的TE緩沖液（Tris和EDTA）將磁納米粒子進行重懸；

赭曲霉毒素A適配體: 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAA

AA-NH₂-3’。

（2）磁納米粒子修飾的適配體與部分互補DNA分子形成部分雜交DNA雙鏈結構