[發(fā)明專利]一種測(cè)定赭曲霉毒素A的超靈敏比色傳感檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710689444.4
• 申請(qǐng)日: 2017-08-14
• 公開（公告）號(hào): CN107723347A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊之雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 樊之雄
• 主分類號(hào): C12Q1/6862
• 分類號(hào): C12Q1/6862
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1.一種測(cè)定赭曲霉毒素A的超靈敏比色傳感檢測(cè)方法，其特征在于包括如下具體步驟：

（1）磁納米粒子修飾赭曲霉毒素A適配體

將新合成的粒徑為200-400nm濃度為1mg mL^-1的羧基修飾的磁納米粒子，用pH7.4的0.01M的磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，再向1mL稀釋好的磁納米粒子中加入0.068mg碳二亞胺和0.15mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺，將其放到搖床上在室溫條件下振蕩活化20min，然后將50μL濃度為10μM的3’端氨基修飾的赭曲霉毒素A適配體DNA片段加入以上活化好的磁納米粒子中，室溫條件下振蕩反應(yīng)3h后，用磁力架吸附磁納米粒子使其在離心管底部聚集，同時(shí)去除上清液以除去未偶聯(lián)的游離適配體DNA分子，然后加入1mL 0.01M的pH8.0的TE緩沖液將磁納米粒子進(jìn)行重懸；

赭曲霉毒素A適配體：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGAAAAA-

NH₂-3’；

（2）磁納米粒子修飾的適配體與部分互補(bǔ)DNA分子形成部分雜交DNA雙鏈結(jié)構(gòu)

將與赭曲霉毒素A適配體部分互補(bǔ)的DNA片段加入步驟（1）中修飾好的磁納米粒子中使其終濃度為1μM，然后將其放入37℃恒溫水浴鍋中孵育2h以使互補(bǔ)的DNA片段充分雜交，再用磁力架對(duì)磁納米粒子進(jìn)行洗脫，以除去游離的DNA分子，再用pH7.0的結(jié)合緩沖液將磁納米粒子進(jìn)行重懸，從而得到磁納米粒子修飾的部分雜交DNA雙鏈結(jié)構(gòu)；

與赭曲霉毒素A適配體部分互補(bǔ)DNA：5’-CCACACCCGATCGGTAACCGACCG-3’；

（3）DNA修飾的金納米粒子探針的制備

將4mL新合成的15-25nm的金納米粒子在9000r/min的條件下離心將其濃縮10倍，并用pH7.4 0.01M的PBS緩沖液將其重懸，測(cè)得其終濃度為25nM，然后將濃縮好的金納米粒子分裝成每管200μL 的兩管，將巰基修飾的兩種DNA探針分子分別加入到濃縮好的金納米粒子中，使其DNA探針分子的終濃度均為100nM，在室溫條件下過夜孵育后，將其在10000r/min條件下離心，以除去未結(jié)合的DNA探針分子，然后用pH7.4 0.01M的磷酸鹽緩沖液將其重懸，得到DNA修飾的金納米粒子探針；巰基修飾的兩種DNA探針分子能夠與步驟（2）中與赭曲霉毒素A適配體部分互補(bǔ)的DNA的兩端能夠完全互補(bǔ)的DNA分子；

探針1：5’ -GATCGGGTGTGGAAAAA-SH-3’，

探針2：5’-SH-AAAAACGGTCGGTTACC-3’；

（4）赭曲霉毒素A比色傳感器的構(gòu)建

將步驟（2）中制備的磁納米粒子修飾的部分雜交DNA雙鏈結(jié)構(gòu)分裝到PCR管中每管100μL ，然后將起始濃度為100000 pg mL^-1赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液10倍梯度稀釋8個(gè)濃度，將其分別加入到PCR管中每管10μL，然后在45℃條件下孵育20-50min；將孵育后的反應(yīng)體系用磁力架進(jìn)行分離，并分別收集含有解離下DNA的上清液；

每種上清液分別取10μL分別加入不同PCR管中，然后在每個(gè)PCR管中分別加入步驟（3）中制備的兩種DNA修飾的金納米粒子探針各5μL、5μL 50U的DNA連接酶、10μL 5×PCR 緩沖液、以及另外兩種DNA分子探針各5μL，使得總的反應(yīng)體系為45μL，將其放入PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)條件為：首先在90℃預(yù)變性30s，然后60℃反應(yīng)2min、90℃變性30s，總共為30個(gè)循環(huán)，其中另外兩種DNA分子探針為模板DNA分子獨(dú)立的兩端；反應(yīng)后分別測(cè)定金納米粒子在630nm和521nm的紫外吸收值，并得到A630/A521的紫外吸收比值，建立赭曲霉毒素A濃度與A630/A521兩者之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)赭曲霉毒素A的定量檢測(cè)；

探針3：5’-CCACACCCGATC-3’，

探針4：5’-GGTAACCGACCG-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定赭曲霉毒素A的超靈敏比色傳感檢測(cè)方法，其特征在于所述的羧基修飾的磁納米粒子的粒徑為300nm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定赭曲霉毒素A的超靈敏比色傳感檢測(cè)方法，其特征在于所述的pH7.0的結(jié)合緩沖液的組成包括：0.01M Tris、0.1M NaCl、0.005M KCl和0.02 mM CaCl₂。