[發明專利]rAAV8-CRISPR-SaCas9系統及在制備乙肝治療藥物中的應用

有效

• 申請號: 201710688779.4
• 申請日: 2017-08-13
• 公開（公告）號: CN107446923B
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發明（設計）人: 宋宏彬;李浩;邱少富;生春雨;楊超杰;劉鴻博;王珊;賈雷立;謝靖;王立貴;李鵬;孫巖松
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/864;C12N7/01;A61K48/00;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 11478 北京市眾天律師事務所
• 代理人: 李新軍

本發明公開了一種gRNA序列，所述序列在CRISPR?Cas9系統中能夠以乙肝病毒基因組特定位點為靶序列進行DNA序列的編輯，本發明還公開了含有該gRNA序列的CRISPR?SaCas9系統和包裝了該系統的重組腺相關病毒。所述系統及包裝病毒顯示出在細胞內及轉基因小鼠機體內強大的HBV清除能力，在連續兩次高劑量注射后的第38天，實驗組小鼠血清中HBsAg、HBeAg的含量相比對照組分別下降62.96±7.59％和65.18±3.08％；血清中HBV DNA的含量相比對照組下降92.82±3.67％；實驗小鼠肝臟及其他臟器均未出現任何病理改變，而且也未檢測到脫靶效應，顯示出本發明提供的gRNA序列及相應的CRISPR?SaCas9系統在制備乙肝治療藥物中的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種gRNA序列及通過CRISPR-Cas9系統對乙肝病毒進行基因編輯的技術，屬于基因突變和基因工程技術領域。

背景技術

乙型肝炎(簡稱：乙肝)是一個嚴重的全球性公共衛生問題。自1982年以來，乙肝疫苗的應用已經在很大程度上預防了乙肝的傳播，但乙型肝炎慢性感染者(乙肝表面抗原HBsAg陽性持續至少6個月)的人數仍居高不下，到2016年的全球HBsAg陽性人數達到2.4億。據估計，全球每年有超過68.8萬人死于慢性乙肝的并發癥，包括肝癌和肝硬化。乙型肝炎是由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起。HBV基因組是部分雙鏈的閉合環狀DNA病毒，通過RNA中間體進行復制。在進入細胞后，HBV DNA包含的核心顆粒就被釋放進入細胞核，隨后HBV雙鏈被宿主細胞修復成為完整的雙鏈結構并進一步形成共價閉合環狀的DNA(cccDNA)。cccDNA在病毒聚合酶的輔助下，不斷地在人體內產生病毒蛋白和新的病毒顆粒。目前公認的化學治療方法包括干擾素-α(Interferon-α，IFN-α)和核苷類似物(Nucleosideanalogue，NAs)。核苷類似物通過抑制多功能逆轉錄酶來阻斷病毒DNA的合成。口服核苷類似物可以有效降低病人體內HBV DNA的水平，但存在停藥后病毒暴發的危險，因此病人需要長期服藥，然而長期服用核苷類似物又會導致抗藥性的產生。相比核苷類似物，干擾素-α具有用藥周期短，不會產生抗藥性的優點。干擾素-α能通過抑制病毒DNA復制和激活機體抗病毒免疫來達到治療效果。但是在接受干擾素-α治療的病人中只有不足10％產生持續的治療作用。并且干擾素-α的副作用多(比如流感樣癥狀、疲勞和血球計數低等)且具有嚴格的適應癥，因此目前乙肝的治療仍有諸多困難。

為了能實現持續抑制HBV的復制與表達，科研究人員致力于研究各種新型藥物。目前正在研究階段的新型治療方法主要包括病毒抑制和宿主細胞抑制兩種方式。病毒抑制的方式主要為通過藥物靶向抑制病毒生命周期的各個時期，包括HBsAg抑制劑、病毒衣殼抑制劑、核糖核酸酶H抑制劑、DNA裂解酶和siRNA藥物。而宿主細胞抑制則主要是利用免疫抑制劑類藥物抑制宿主的免疫反應進而減輕病毒引發的炎癥。然而要想治愈慢性乙肝，則必須徹底破壞或清除HBV的復制根源—HBV DNA，然而目前尚沒有藥物能夠達到這一目的。近些年發展起來的基因編輯技術，有望成為根治乙型肝炎的最佳途徑。從人工合成的鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)到最新的第三代基因編輯技術成簇的規律間隔的短回文重復序列(Clustered RegΜLarly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)-Cas9系統，其發展速度快，能夠實現對任意DNA序列的精確編輯。利用這些基因編輯工具，研究人員則可以直接靶向HBV DNA，正因如此，基因編輯技術也為從根本上治愈慢性乙肝提供了新的途徑。