[發明專利]一種單管中多位點單核苷酸多態性的檢測方法

有效

• 申請號: 201710687447.4
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107365850B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 羅光華;毛慧慧
• 申請（專利權）人: 常州市第一人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務所
• 代理人: 劉奇

本發明涉及一種單管中多位點單核苷酸多態性的檢測方法，屬于單核苷酸多態性檢測技術領域。本發明提供的在單管中多位點單核苷酸多態性的檢測方法包括以下步驟：1)采用不同的熒光基團分別標記不同的探針，得到不同熒光基團標記的探針；所述不同的探針對應不同的單核苷酸位點；不同的探針具有不同的Tm值；2)將所述步驟1)得到的標記探針和靶基因混合置于同一反應體系中進行聚合酶鏈反應；3)對所述步驟2)反應體系的熒光信號進行收集，得到熔解曲線，根據熔解曲線的Tm值的變化得到多位點單核苷酸多態性檢測結果。本發明提供的檢測方法在單管中同時檢測多個SNP位點，節省了時間，降低了成本，檢測的準確度高，適合于大規模基因型篩選。

技術領域

本發明涉及單核苷酸多態性檢測技術領域，具體涉及一種單管中多位點單核苷酸多態性的檢測方法。

背景技術

大約90％的人類基因變異都表現在DNA單個堿基的變化上，稱為單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP的檢測為致病基因的鑒定、藥物靶向治療的建立以及個體化給藥提供了可能。因此，低成本、高效率、操作簡便的檢測SNP的新技術就顯得尤為緊迫和重要。

近幾年，以熒光基團標記的探針技術已經廣泛用于快速的SNP基因分型。其中堿基猝滅技術是一種不依賴鳥嘌呤的單熒光標記的單探針技術，僅需要一對引物和一個探針，就可以實現SNP的篩查。研究表明堿基猝滅技術與DNA測序技術具有一致性，適合大規模的基因分型研究。目前，堿基猝滅探針技術已在單一熒光通道單管中成功完成了對多種基因的SNP位點的檢測(如A1AT、線粒體DNA、MT2A基因、ABCC11、PROC基因、CYP4F2基因、EPHX1基因以及VKORC1基因等)。但是，該技術僅在單一熒光通道單管僅能檢測1～2個SNP位點，具有很大的局限性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種單管中多位點單核苷酸多態性的檢測方法。本發明提供的檢測方法在單管中同時檢測多個SNP位點，節省了時間，降低了成本，檢測的準確度高，適合于大規模基因型篩選。

本發明提供了一種在單管中多位點單核苷酸多態性的檢測方法，包括以下步驟：

1)采用不同的熒光基團分別標記不同的探針，得到不同熒光基團標記的探針；所述不同的探針對應不同的單核苷酸位點；不同的探針具有不同的Tm值；

2)將所述步驟1)得到的標記探針和靶基因混合置于同一反應體系中進行聚合酶鏈反應；

3)對所述步驟2)反應體系的熒光信號進行收集，得到熔解曲線，根據所述熔解曲線的Tm值的變化得到多位點單核苷酸多態性檢測結果；

所述收集過程中，不同的熒光基團對應不同的熒光檢測通道。

優選的是，所述熒光基團包括：FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、CY3和CY5中的多個。

優選的是，不同探針所對應的Tm值獨立地大于25℃。

優選的是，所述靶基因為基因組DNA。

優選的是，每25μL步驟2)的反應體系包括：10×PCR緩沖液2.5μL，25mM MgCl₂1.5μL，0.2mM 4×dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100μM前引物0.1μL，100μM后引物0.1μL，10μM標記探針各0.1μL，ddH₂O補足至25μL。

優選的是，所述步驟2)聚合酶鏈反應的條件為：95℃預變性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40個循環。

優選的是，所述步驟3)中的熔解曲線根據所述收集到的熒光信號通過PCR熔解曲線分析程序得到。