[發明專利]一種單管中多位點單核苷酸多態性的檢測方法

有效

• 申請號: 201710687447.4
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107365850B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 羅光華;毛慧慧
• 申請（專利權）人: 常州市第一人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 11569 北京高沃律師事務所
• 代理人: 劉奇

1.一種基于堿基猝滅技術在單管中多位點單核苷酸多態性的檢測用引物和探針組：

所述位點包括以下SNP位點：apoM rs707921、apoM rs707922和MCP-1 rs1024611；

所述apoM rs707921對應的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探針為如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的3’端標記有FAM且5’端不進行標記的物質；

所述apoM rs707922對應的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探針為如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的3’端標記有FAM且5’端不進行標記的物質；

所述MCP-1 rs1024611對應的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，探針為如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的3’端標記有ROX且5’端不進行標記的物質和如SEQID NO:8所示核苷酸序列的3’端標記有FAM且5’端不進行標記的物質；

所述引物和探針的制備和使用方法包括以下步驟：

1)采用不同的熒光基團分別標記不同的探針，得到不同熒光基團標記的探針；所述探針為單熒光標記的探針；所述不同的探針對應不同的單核苷酸位點；所述不同的單核苷酸位點對應不同的探針；不同的探針具有不同的Tm值；所述探針不依賴于鳥嘌呤；

2)將所述步驟1)得到的標記探針和靶基因混合置于同一反應體系中進行聚合酶鏈反應；所述聚合酶鏈反應的條件為：95℃預變性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40個循環；

3)對所述步驟2)反應體系的熒光信號進行收集，得到熔解曲線，根據所述熔解曲線的Tm值的變化得到多位點單核苷酸多態性檢測結果；所述熔解曲線根據所述收集到的熒光信號通過PCR熔解曲線分析程序得到；所述PCR熔解曲線分析程序的條件為：95℃30s，25℃4min，然后以0.1℃/s的溫度轉化率升溫至80℃；

所述收集過程中，不同的熒光基團對應不同的熒光檢測通道：

當用6-FAM標記apoM的兩個SNP位點的探針，用ROX標記MCP-1的探針時，通過FAM和ROX通道收集每個循環的熒光數據，同時對apoMrs707921、apoM rs707922和MCP-1 rs1024611分型。