[發明專利]一種無乳鏈球菌WC1535△cps及其構建和應用

有效

• 申請號: 201710686718.4
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107603933B
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 張德鋒;盧邁新;可小麗;劉志剛;葉星;曹建萌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 顏春艷

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種無乳鏈球菌WC1535△cps及其構建和應用；本發明的莢膜缺失型魚源無乳鏈球菌菌株為無乳鏈球菌WC1535△cps，于2017年6月30日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60208；該菌株安全性高，不存在毒力返強的風險，而且免疫原性高，能夠保護受免疫魚抵抗無乳鏈球菌的入侵，同時該弱毒活疫苗易培養、使用簡單、生產成本低；本發明所涉及的菌株可用于制備魚鏈球菌病的弱毒活疫苗，具有極高的商業價值。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種莢膜缺失的魚源無乳鏈球菌弱毒株，無乳鏈球菌WC1535△cps及其構建和應用。

背景技術

魚鏈球菌病主要是由無乳鏈球菌和海豚鏈球菌引起的。目前，魚鏈球菌病的防控主要依賴抗生素、消毒劑、微生態制劑和疫苗免疫等。由于治療過程中抗生素的大量使用，使得病原菌出現了耐藥性，藥物治療和預防效果顯著下降。而針對魚鏈球菌病的疫苗主要是滅活疫苗，滅活疫苗不僅因為需要注射、操作不便和效果不理想等原因，導致疫苗的使用范圍非常有限；而且滅活疫苗接種后不能在動物體內進行繁殖，通常免疫劑量較大，保護周期相對較短，常常需要多次免疫接種，單次免疫不能產生較強的免疫保護效果。因此，開發有效的弱毒活疫苗對預防魚鏈球菌病具有重要的現實意義。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種莢膜缺失的魚源無乳鏈球菌弱毒株，即無乳鏈球菌WC1535△cps。該菌株毒性小、免疫原性強，并且對魚的致病性顯著降低，但是能夠在魚體長時間存活，可以刺激魚體產生抗體，具有良好的保護效果。

本發明的目的之二是提供了所述無乳鏈球菌WC1535△cps的構建。

本發明的目的之三是提供了所述無乳鏈球菌WC1535△cps的應用。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

本發明所述的無乳鏈球菌WC1535△cps，為莢膜缺失的魚源無乳鏈球菌弱毒株，于2017年6月30日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60208，外文名稱為Streptococcus agalactiae。

所述無乳鏈球菌WC1535△cps的構建方法，包括如下步驟：

(1)將重組質粒pSET4s-cpsCm經過電轉化至魚源無乳鏈球菌WC1535株感受態細胞，涂布于含有氯霉素的BHI平板，置于28±2℃倒置培養30～40h；

(2)再挑取培養所得單克隆至含有氯霉素的BHI液體培養基中，28±2℃培養至對數生長期，然后稀釋10000倍，涂布于無抗性的BHI平板上，于37℃倒置培養；得到所述無乳鏈球菌WC1535△cps。

挑取單克隆進行菌落PCR驗證，引物為cps-dF和cps-dR。

cps-dF：5′-CTGACAACAATGGATTTTGGGTG-3′

cps-dR：5′-CAGCATCAGTAAAAGGTTCCCATA-3′

陽性敲除克隆可以擴增到預期大小為3145bp的PCR產物。野生株PCR產物預期大小為17711bp，由于該片段長度較長，通常的Taq酶不能擴增如此長度的PCR產物，因此，野生株PCR擴增產物為陰性。缺失株PCR擴增產物進行測序分析，結果發現突變株的cps基因簇發生了缺失，這表明已經成功構建了cps缺失突變株，命名為WC1535△cps，于2017年6月30日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60208，外文名稱為Streptococcusagalactiae。菌株WC1535株和WC1535△cps株樣品分別經過固定、負染，通過透射電鏡觀察菌株莢膜。結果表明，與野生株相比，突變株WC1535△cps株的莢膜出現缺失。