[發(fā)明專利]一種無乳鏈球菌WC1535△cps及其構(gòu)建和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710686718.4
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107603933B
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發(fā)明（設計）人: 張德鋒;盧邁新;可小麗;劉志剛;葉星;曹建萌
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 佛山幫專知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 顏春艷

1.一種無乳鏈球菌WC1535△cps，其特征在于，所述無乳鏈球菌WC1535△cps為莢膜缺失的魚源無乳鏈球菌弱毒株，所述莢膜缺失為莢膜基因簇全部缺失，其缺失基因分別為cpsA-cpsL和neuA-neuD，缺失片段長度的其大小為15623bp；于2017年6月30日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No:60208，外文名稱為Streptococcusagalactiae。

2.如權利要求1所述無乳鏈球菌WC1535△cps的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)先將重組質(zhì)粒pSET4s-cpsCm經(jīng)過電轉(zhuǎn)化至魚源無乳鏈球菌WC1535株感受態(tài)細胞，再涂布于含有氯霉素的BHI平板，最后置于28±2℃倒置培養(yǎng)30～40h；

(2)挑取培養(yǎng)所得單克隆菌落至含有氯霉素的BHI液體培養(yǎng)基中，28±2℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后稀釋10000倍后涂布于無抗性的BHI平板上，于37℃倒置培養(yǎng)；PCR檢測和測序驗證的陽性克隆，即得到所述無乳鏈球菌WC1535△cps。

3.如權利要求2所述無乳鏈球菌WC1535△cps的構(gòu)建方法，其特征在于，所述魚源無乳鏈球菌WC1535感受態(tài)細胞的制備方法，具體步驟如下：

(1)魚源無乳鏈球菌WC1535復蘇于BHI培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)過夜；

(2)取過夜培養(yǎng)得到的菌液加入到新鮮的BHI液體培養(yǎng)基中，30℃搖床擴大培養(yǎng)5～6h，OD₆₀₀＝0.6時，收集菌體；

(3)經(jīng)擴大培養(yǎng)的菌液在5000r/min離心10min，去除上清液；

(4)所得菌體使用體積百分含量為10％～15％的甘油輕輕懸浮，離心去上清；得到所述魚源無乳鏈球菌WC1535感受態(tài)細胞。

4.如權利要求2所述無乳鏈球菌WC1535△cps的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pSET4s-cpsCm由pSET4S質(zhì)粒和cps-up-Cm-cps-down基因片段的無縫克隆得到，具體為：

(1)取雙酶切后的pSET4S質(zhì)粒與cps-up-Cm-cps-down基因片段，然后加入Seamlesscloning kit連接體系，混勻后50±2℃處理25～35min，得到連接液；所述Seamlesscloning kit連接體系與cps-up-Cm-cps-down基因片段和雙酶切后的pSET4S質(zhì)粒三者之間的體積比為1：3：6；

(2)取步驟(1)中所得連接液，加入10倍連接液體積的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，冰上孵育25～35min后，42±2℃熱激90s，冰上孵育2～3min，然后37℃復蘇25～35min，涂布于含有氯霉素的LB平板上；PCR篩選陽性克隆，陽性PCR產(chǎn)物進行測序驗證，得到所述的重組質(zhì)粒命名為pSET4s-cpsCm。

5.如權利要求4所述無乳鏈球菌WC1535△cps的構(gòu)建方法，其特征在于，所述雙酶切后的pSET4S質(zhì)粒的構(gòu)建：

提取pSET4S質(zhì)粒，經(jīng)過HindIII和EcoRI雙酶切，37±2℃酶切2～5h，最后用0.8％瓊脂糖凝膠回收產(chǎn)物，得到所述雙酶切后的pSET4S質(zhì)粒；其中所述酶切體系為：pSET4S 1μg、HindIII 1U、EcoRI 1U、10×Buffer 3μL、補ddH₂O至30μL。