[發(fā)明專利]基于全自動(dòng)在線固相萃取?超高效液相色譜?線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水中藻類毒素的方法

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• 申請(qǐng)日: 2017-08-11
• 公開（公告）號(hào): CN107389825A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐瀟穎;劉柱;羅金文;陳萬(wàn)勤;梁晶晶;周霞;趙超群;丁宇琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙)33213
• 代理人: 沈淵琪

1.基于全自動(dòng)在線固相萃取-超高效液相色譜-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定水中藻類毒素的方法，其特征在于包括如下步驟：

1）混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液的配制：分別精密移取0.5mL 5μg/mL的各藻類毒素儲(chǔ)備液至5mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1.0 mL混合液至另一10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，于-18℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

2）同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液的配制：精密移取0.1 mL 10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取0.5 mL定容的容量瓶中內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液，于-18℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

3）線性溶液的制備：用超純水稀釋藻類毒素濃度在0.02-8.0 ng/mL范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)濃度均為0.5 ng/mL的線性標(biāo)準(zhǔn)溶液，供色譜測(cè)定；

4）加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品溶液的制備：取不含藻類毒素的樣品，置50 mL高速離心管中，精密加入不同量的步驟1）制得的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，獲得檢出限為0.005 ng/mL、定量限為0.015 ng/mL、低、中、高不同水平濃度分別為0.02 ng/mL、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL的加標(biāo)試驗(yàn)樣品，再向該加標(biāo)試驗(yàn)樣品中精密加入步驟2）同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，使制得加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品溶液內(nèi)標(biāo)濃度均為0.5 ng/mL，過膜后，供色譜測(cè)定；

5）用全自動(dòng)在線固相萃取-超高效液相色譜-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品溶液、線性溶液及加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品溶液：

（a）測(cè)定：進(jìn)樣過程：由程序控制使自動(dòng)進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)200 μL連續(xù)2次進(jìn)樣，吸取樣品溶液、線性溶液及加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品溶液注入色譜儀中，以在線固相萃取-超高效液相色譜-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法，測(cè)定樣品溶液中的目標(biāo)化合物峰面積、內(nèi)標(biāo)化合物峰面積；線性溶液中目標(biāo)化合物峰面積、內(nèi)標(biāo)化合物峰面積；加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品溶液中目標(biāo)化合物峰面積、內(nèi)標(biāo)化合物峰面積，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及試樣溶液中待測(cè)組分的響應(yīng)值均應(yīng)在監(jiān)測(cè)器的線性范圍之內(nèi)；

進(jìn)樣分析具體過程如下：在富集泵（1）的作用下，由自動(dòng)進(jìn)樣器（2）流向在線固相萃取柱（4），六通閥（3）在0-3min均保持初始狀態(tài)，即1號(hào)位和2號(hào)位相通，基質(zhì)干擾物至廢液池，分析流路5號(hào)位與6號(hào)位相通，流入檢測(cè)器（7）的狀態(tài)；在3-6min閥切換至1號(hào)位與6號(hào)位相通，將固相萃取柱（4）中的目標(biāo)化合物反沖進(jìn)入分析柱（6），在6min閥切換至初始位置，即1號(hào)位和2號(hào)位相通，將富集柱切出分析流路，使經(jīng)過分析柱分離的目標(biāo)物進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器（7）進(jìn)行分析；

色譜條件如下：

在線固相萃取液相條件：

富集柱：Oasis HLB Direct Connect HP ，2.1×30 mm，20 μm，

流動(dòng)相：A相：甲醇，B：0.1%甲酸-水，梯度洗脫，

流速：0.8 mL/min；

分離分析液相條件：

色譜柱：Waters Cortecs C18， 2.1×100 mm， 2.7 μm，

流動(dòng)相：A相：甲醇，B：5mM乙酸銨，梯度洗脫，

流速：0.4 mL/min，

柱溫：35 ℃，

進(jìn)樣量：400 μL；

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀：線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀，

離子源：電噴霧離子源，

掃描方式：正離子掃描，

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，

噴霧電壓：4.5kV，

離子溫度：450 ℃，

霧化器壓力GS1：40PSI，

輔助器壓力GS2：40PSI，

氣簾氣壓力CUR：35PSI；

（b）曲線方程斜率、曲線方程截距的計(jì)算

以線性溶液中的目標(biāo)化合物峰面積比內(nèi)標(biāo)化合物峰面積定量，得到曲線方程A=aC+b，

式中C為溶液中目標(biāo)化合物殘留量，單位為 ng/mL；A為目標(biāo)化合物峰面積比內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比；a為曲線方程斜率；b為曲線方程截距，根據(jù)線性溶液的濃度、測(cè)出的線性溶液中目標(biāo)化合物峰面積、內(nèi)標(biāo)化合物峰面積，采用擬合法，計(jì)算得出a和b；

（c）結(jié)果分析：樣品溶液中未知組份的保留時(shí)間分別與線性溶液中的目標(biāo)化合物在同一色譜柱上的保留時(shí)間相比較，樣品中某組份包括定量及定性離子的保留時(shí)間與線性溶液中某一藻類毒素的保留時(shí)間的絕對(duì)值在0.05min內(nèi)，認(rèn)定為該種藻類毒素，樣品溶液中的目標(biāo)化合物殘留量濃度C，其單位為ng/mL，計(jì)算公式如下：

C=(A-b)/a

式中：A為樣品溶液中的目標(biāo)化合物峰面積比內(nèi)標(biāo)化合物峰面積；

a和b由步驟（b）計(jì)算得到；

（d）結(jié)果驗(yàn)證：加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品溶液按步驟c計(jì)算出實(shí)際的目標(biāo)化合物殘留量濃度C，與其理論的目標(biāo)化合物殘留量濃度C相比較，計(jì)算其平均回收率；

（e）目標(biāo)物確證：利用線性離子阱功能下，選擇增強(qiáng)子離子模式獲得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的子離子高增強(qiáng)二級(jí)質(zhì)譜圖EPI并編輯譜庫(kù)，將對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物名稱、相對(duì)分子量、CAS號(hào)以及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖補(bǔ)充完整，對(duì)樣品中低濃度藻類毒素進(jìn)行確證時(shí)，可獲得樣品中藻類毒素的EPI譜圖后，進(jìn)行定性譜庫(kù)檢索，依據(jù)兩者匹配度進(jìn)行確證。