[發明專利]聚離子液體磁性納米復合物及其對痕量循環腫瘤細胞特異性富集和檢測的應用

有效

• 申請號: 201710686464.6
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107525920B
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 印曉星;于妍妍;郁超;湯道權;楊淵;李成林
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;C12N5/09
• 代理公司: 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

本發明公開了一種聚離子液體磁性納米復合物及其對痕量循環腫瘤細胞特異性富集和檢測的應用，本發明提供了一種具有高靈敏度，高特異和高準確度的磁性納米生物探針，并用于對CTCs的分離和富集中。磁珠表面豐富的羧基官能團，能夠通過與抗體的氨基化學鍵合，提高與EpCAM抗體偶聯的效率，結合磁珠本身較大的比表面積以及良好的分散性，顯著提高了對CTCs的富集效率。同時，聚離子液體本身優良的生物相容性，也顯著降低了對細胞的毒性，從而提高了富集后細胞的成活率。

技術領域

本發明屬于醫學檢測領域，具體涉及一種聚離子液體磁性納米復合物及其應用。

背景技術

惡性腫瘤是威脅人類健康和導致死亡的主要原因之一。腫瘤細胞具有向周圍組織侵襲乃至向全身擴散和轉移的特性。據報道，約90％的腫瘤患者死于腫瘤侵襲和轉移。分子生物學和臨床研究結果表明，腫瘤轉移在腫瘤發生的早期就已經出現。然而目前腫瘤的發現和臨床診斷仍依賴于影像學檢查及傳統腫瘤標志物的監測，難以在早期即發現腫瘤的轉移或復發。因此，為了進一步提高腫瘤治療的療效，亟需尋找更有效的療效和預后檢測指標及治療靶點。研究發現，在腫瘤轉移的過程中，在患者的外周血中檢測到循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)，因此，對此類腫瘤細胞的早期發現和檢測有可能成為發現腫瘤早期轉移的一種有效手段，對腫瘤的早期診斷、預后判斷及治療效果評價等方面具有重要的參考價值。

CTCs一般是由原發灶腫瘤細胞入血后轉變而來。它在外周血中的數量極其稀少，通常腫瘤患者的血液中CTCs的濃度只有1～10個/mL。因而對CTCs的檢測一般首先要經過分離富集的預處理步驟，以去除大部分血液中正常細胞。對CTCs的分離和富集主要分為物理法和生物化學法。物理法主要利用CTCs和血液正常細胞在物理性質方面的差異，如尺寸、密度、懸浮力大小等；生物化學法通常依賴于細胞膜表面的抗原與偶聯在分離載體上的抗體相結合，達到分離捕獲CTCs的目的。

CellSearch系統是目前唯一通過美國食品藥品監督管理局(FDA)批準應用于臨床分離富集CTCs的儀器，其主要原理正是利用偶聯了EpCAM抗體的磁顆粒與腫瘤細胞表面的抗原相結合，然后在磁場的作用下分離。對富集得到的CTCs，常用有分子生物學法(如定量PCR)和細胞生物學法(如免疫熒光、免疫細胞化學染色等)進行鑒定。然而，該系統的主要缺陷是CTCs群體異源，一些CTCs不表達EpCAM。此外，在該系統中，捕獲的CTCs會失去了原有的活力。

四氧化三鐵(Fe₃O₄)磁性納米球是目前細胞分離和富集方面的磁性納米材料之一。相比于納米顆粒，Fe₃O₄納米球(MNs)在磁性分離過程中的響應速度更快，在外加磁場的定向控制下，通過清洗和解吸操作，可將目標物從多組分環境中快速分離出來，省去了離心、過濾等繁瑣的步驟，為復雜體系的分離帶來了極大便利。但是，納米尺寸的Fe₃O₄MNs因其粒徑小、磁性強等特點，極易發生團聚，使其很難應用在CTCs的分離和富集方面。

發明內容

本發明的目的是的現有技術的基礎上，采用磁性分離法，以羧基聚離子液體(PIL)功能化的四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米球(MNs)為分離載體，以上皮細胞黏附分子抗體(anti-EpCAM)作為血液中CTCs的特異性識別分子，通過將其與MNs進行生物偶聯制備免疫磁珠(IMNs)，構建一種可直接用于對乳腺癌、宮頸癌、肝癌等腫瘤細胞中痕量CTCs高效分離、富集、鑒定和檢測的納米生物探針，為惡性腫瘤的早期轉移診斷以及預后評估提供重要的參考依據。

本發明的另一目的是提供一種上述納米生物探針在痕量循環腫瘤細胞特異性富集和檢測方面的應用。

本發明的目的可以通過以下措施達到：

一種能夠對痕量循環腫瘤細胞特異性富集或檢測的聚離子液體磁性納米復合物，其特征在于它由如下步驟制備而成：