[發明專利]一種強廣譜啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201710686341.2
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107287201B
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;楊森;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;C12N15/75;C12N15/81
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種強廣譜啟動子及其應用，屬于基因工程領域。本發明通過分子手段將原核細菌保守啟動子序列插入一個具有高活力的釀酒酵母啟動子的非核心區域，得到的一種強廣譜啟動子有多個宿主，該啟動子在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母中均具有很強的啟動子活力，滿足目前對廣譜的分子改造工具和基因表達框的需求。

技術領域

本發明涉及一種強廣譜啟動子及其應用，屬于基因工程領域。

背景技術

啟動子是位于結構基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確的結合并具有轉錄起始的特異性。由于不同宿主之間RNA聚合酶存在不同程度的差異，因此，它們所識別的啟動子也存在著保守序列上的差異，導致目前所鑒定的啟動子只能在某一特定宿主或少數幾個宿主中具有活性。

隨著分子生物學的不斷發展，分子改造工具的開發以及代謝途徑的優化正成為目前的主流研究方向。但是，由于啟動子的宿主范圍的限制，導致目前所開發的改造工具和優化后的合成途徑只能在某一特定范圍宿主內使用，大大限制了其應用范圍，嚴重的降低了一些研究的重要意義。目前關于多宿主啟動子僅有的一些少量的報道，且主要集中于細菌范圍內的廣譜啟動子構建，如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌穿梭啟動子Pveg，還沒有原核細菌和真菌之間穿梭啟動子的報道。因此，一個具有在包含革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和酵母菌的廣泛宿主范圍內具有活性的啟動子具有很大的研究意義和應用價值。

發明內容

為了滿足目前對廣譜的分子改造工具和基因表達框的需求，本發明提供了一個強廣譜啟動子，并將其應用至廣譜表達框和廣譜質粒的構建。

本發明的第一個目的是提供一個廣譜啟動子，該啟動子在多個宿主具有啟動子的活性，使下游基因得到表達的能力。

在本發明的一種實施方式中，所述廣譜啟動子為P_sh，其序列如SEQ ID NO.1所示，該啟動子在革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌中均具有啟動子活性。

本發明的第二個目的是提供一種強廣譜啟動子的構建方法：

(1)挑選一個具有高活力的釀酒酵母啟動子；

(2)在上述啟動子非核心區域插入原核細菌啟動子保守序列；

(3)將構建好的新啟動子和熒光蛋白基因相連，其中采用原核細菌通用的核糖體結合位點；

(4)將啟動子和熒光蛋白基因一起分別插入到多個宿主的表達載體上，并轉入相應宿主，通過熒光顯微鏡和熒光酶標儀來進行定性和定量。

在本發明的一種實施方式中，所述真核啟動子是報道的釀酒酵母啟動子P_min，其序列如SEQ ID NO.2所示。在本發明的一種實施方式中，所述原核細菌啟動子保守序列是指包含TTGACA和TATAAT兩段DNA序列，其間隔的序列如SEQ ID NO.3所示。在本發明的一種實施方式中，所述的原核細菌通用核糖體結合位點，序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明的第三個目的是提供一種強廣譜啟動子的應用，所述的廣譜啟動子P_sh在革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和真菌中均具有很強的啟動子活力。