[發明專利]一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法

在審

• 申請號: 201710685299.2
• 申請日: 2017-08-11
• 公開（公告）號: CN107267475A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 李大偉;周光大;林建華
• 申請（專利權）人: 浙江福斯特新材料研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

技術領域

本發明涉及生物醫藥材料制備技術領域，尤其涉及一種采用金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的高效制備方法。

背景技術

硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類高度保守的緊密球形蛋白，由100余個氨基酸殘基，形成一個“TRX折疊”的穩定三維結構，廣泛分布于各種生物體內。Trx是一個具有氧化還原作用的小分子功能性蛋白，相對分子質量約12kDa,含有一個保守的氧化還原活性位點Cys-Gly-Pro-Cys，其中的兩個Cys殘基能夠通過轉移電子還原其他含二硫鍵的蛋白質，可逆催化許多氧化還原反應，賦予Trx獨特的生物學特性，使得生物體內的一系列生理反應得以順利進行。

Trx具有抗氧化、抗炎癥、抗過敏和抗衰老等多種功能，可以調節細胞生長、抑制細胞凋亡、調節基因轉錄等，對維持生物體內穩定的氧化還原狀態具有重要的作用。此外，Trx與植物抗逆性相關，在植物遺傳性狀改良等方面具有廣泛的應用前景，如參與植物抗旱、耐熱和抗氧化脅迫過程，調節抗逆基因的表達等。

1964年，Reichard等首次發現在大腸桿菌中，Trx作為核苷酸還原酶的供體參與DNA的合成。大腸桿菌的Trx結構是一種結合緊密的球形蛋白質，由5個β折疊構成一個疏水核心，核心的終末端被4個α螺旋包繞。在酵母中，Trx是DNA快速復制的重要保障。酵母細胞溶質的硫氧還蛋白系統與大腸桿菌的相似，在細菌和酵母菌中，Trx作為PAPS將硫酸鹽還原為亞硫酸鹽，完成了硫的同化。

在人體中，硫氧還蛋白又稱為成人T細胞白血病衍生因子，與NADPH和硫氧還蛋白還原酶共同組成Trx還原系統，對維持體內穩定的氧化還原狀態具有重要的作用。人體內的硫氧還蛋白可對多種轉錄因子如NF，KB，AP1發揮調節作用，并可促進細胞的增殖及抑制細胞的凋亡。Trx也可直接清除活性氧，它可將O^-轉化為OH^-。Trx還能保護內皮細胞和腎臟的缺血再灌注損傷等。

Trx能抑制許多抗病變、抗癌變藥物所致的凋亡，保護細胞處于氧化還原狀態，免受傷害，并且研究發現，急性HIV感染的細胞中Trx短暫下調，感染后期血漿Trx升高，因此血漿Trx可成為預測和評價某些疾病的重要的生物學指標。硫氧還蛋白對生物體的重要功能，具有其他藥物無可替代的作用，但是由于硫氧還蛋白在生物體內的含量特別少，而且只有在應激狀態下才會產生硫氧還蛋白，目前世界范圍內，還沒有能夠對硫氧還蛋白進行規模化生產的方法，產率和純度等方面的瓶頸都不利于對硫氧還蛋白的醫學醫用方面的開展，本方法在一定程度上可以解決目前硫氧還蛋白制備方法的難題，為其相關的生物醫藥領域的應用提供基礎。

固定金屬離子親和色譜(金屬螯合親和色譜)是近幾年發展起來的一種新型分離技術，主要根據蛋白質中組氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸殘基與色譜柱上的金屬離子螯合作用形成絡合物而實現分離蛋白質的目的。固定金屬離子親和色譜(金屬螯合親和色譜)的固定相是由基質、絡合劑和金屬離子三部分組成。基質用以擔載金屬螯合配體。絡合劑的作用是將金屬離子固定在基質上。固定金屬與絡合劑形成可與蛋白質結合的金屬螯合配體。與其他分離蛋白質技術相比，該方法因具有配體穩定，蛋白吸附量大，洗脫條件溫和，成本低等優點，已經成為一種重要的蛋白質分離方法。

發明內容

本發明針對目前生物醫藥領域等應用中，硫氧還蛋白純化制備技術難度大的瓶頸而導致一定程度上抑制硫氧還蛋白廣泛應用的問題，提供了一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種金屬螯合親和色譜純化硫氧還蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)將硫氧還蛋白重組質粒(其基因序列如SEQ ID NO.1所示)置于大腸桿菌的細胞中，得菌液；在LB細胞培養液(含有卡那霉素25μg/mL和100μg/mL腺苷一磷酸，溶劑為水)中培養細胞(菌液與細胞培養液體積比為1：100)，使重組質粒表達完成，之后細胞經預冷到4℃的PBS溶液和室溫下的雙蒸水分別沖洗若干次，加入細胞裂解液，細胞裂解液的加入量與細胞培養液的體積比為1：1～1：20，搖動至溶液成透明狀，6000～16000r/min下離心5～60min，去除細胞碎片，分離上清液及菌沉淀，在上清液中加入用緩沖溶液平衡好的固定金屬離子的羧甲基天冬氨酸化的瓊脂糖凝膠微球，固定金屬離子的物質的量與細胞培養液的體積的比例為1：1～1：20(mol：mL)，孵育5～80min后，離心分離；